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Artículo de método

Análisis de la señalización lipídica en fotorreceptores de Drosophila mediante espectrometría de masas

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DOI:

10.3791/63516

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7 de marzo de 2022

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1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

En este artículo

Resumen

El manuscrito presenta protocolos de espectrometría de masas versátiles, robustos y sensibles para identificar y cuantificar varias clases de lípidos de fotorreceptores de Drosophila .

Resumen

La activación de la fosfolipasa Cβ (PLCβ) es un paso esencial durante la transducción sensorial en los fotorreceptores de Drosophila . La actividad de PLCβ da lugar a la hidrólisis del lípido de membrana fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P2], lo que conduce en última instancia a la activación de canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP similares (TRPL). La actividad de PLCβ también conduce posteriormente a la generación de muchas especies de lípidos, varias de las cuales se ha propuesto que desempeñan un papel en la activación de TRP y TRPL. Además, se ha propuesto que varias clases de lípidos desempeñan un papel clave en la organización de la biología celular de los fotorreceptores para optimizar las reacciones de señalización para una transducción sensorial óptima. Históricamente, estos descubrimientos han sido impulsados por la capacidad de aislar mutantes de Drosophila para enzimas que controlan los niveles de lípidos específicos y realizar análisis de la fisiología de los fotorreceptores en estos mutantes. Más recientemente, se han desarrollado potentes métodos de espectrometría de masas para el aislamiento y el análisis cuantitativo de lípidos con alta sensibilidad y especificidad. Estos son particularmente adecuados para su uso en Drosophila , donde ahora es posible el análisis de lípidos a partir de fotorreceptores sin la necesidad de marcar con radionúclidos. En este artículo, se cubren las consideraciones conceptuales y prácticas en el uso de la espectrometría de masas lipídicas para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa de varios lípidos de señalización en fotorreceptores de Drosophila . Junto con los métodos existentes en genética molecular y análisis fisiológico, es probable que estos lípidos aumenten el poder de los fotorreceptores como sistema modelo para los descubrimientos en biología.

Introducción

La fototransducción en Drosophila está mediada por una cascada PLCβ acoplada a la proteína G que conduce a la activación de los canales activados por luz TRP y TRPL1. PLCβ hidroliza el fosfolípido unido a la membrana, fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P2] y genera diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3). A continuación, el DAG es fosforilado por la DAG-quinasa para generar ácido fosfatídico (PA). Posteriormente, a través de una serie de reacciones que implican la generación de intermedios lipídicos, se regenera PI(4,5)P2 2. Varios componentes de este ciclo PI(4,5)P2 tienen funciones en los fotorreceptores de Drosophila . El mecanismo por el cual la activación del PLC conduce a la activación de canales TRP y TRPL permanece sin resolver. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren que los intermedios lipídicos generados por la hidrólisis de PI(4,5)P2 pueden mediar en este proceso3. Por lo tanto, es muy importante identificar y cuantificar estos intermedios lipídicos para arrojar luz sobre el mecanismo de activación de TRP y TRPL en la fototransducción de Drosophila . Además de su papel en la fototransducción per se, los lípidos también desempeñan varios papeles importantes en la organización celular de los fotorreceptores (revisado en3). La comprensión de estas funciones de los lípidos se ve favorecida por la capacidad de detectar y cuantificar sus niveles in vivo. Este artículo proporciona una visión general, así como protocolos para la elección e implementación de métodos para cuantificar los lípidos de los fotorreceptores de Drosophila .

Históricamente, el análisis de lípidos consistía en el fraccionamiento por clases químicas seguido del análisis de clases individuales. Para identificar y cuantificar con éxito los lípidos, se han desarrollado muchos métodos analíticos que son análisis de lípidos dirigidos o no dirigidos 4,5,6,7,8,9,10. El análisis dirigido se centra en los lípidos conocidos y utiliza un método específico con alta sensibilidad para el análisis cuantitativo de estos lípidos específicos. El análisis de lípidos no dirigido tiene como objetivo detectar muchas especies de lípidos en una muestra simultáneamente. Estos métodos analíticos incluyen cromatografía en capa fina (TLC)4, cromatografía de gases (GC)5, cromatografía líquida (LC)6, ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA)7, resonancia magnética nuclear (RMN)8, marcaje con radionúclidos y espectrometría de masas (MS)9,10. Aunque el marcaje radiactivo es un método sensible para la detección de lípidos y puede utilizarse en el contexto de células cultivadas, su uso en el análisis de lípidos en organismos intactos como Drosophila es un reto debido a las consideraciones de seguridad del marcaje radioactivo de animales voladores vivos. El otro desafío con el marcaje radiactivo es que depende del etiquetado de todos los grupos de precursores hasta casi el equilibrio, y esto puede ser difícil en el contexto de modelos in vivo.

El análisis exhaustivo de lípidos mediante EM es un avance reciente que ha sido posible gracias al desarrollo de las tecnologías modernas de EM11. El análisis de lípidos basado en MS ofrece varias ventajas, entre las que se incluyen tamaños de muestra pequeños, aplicabilidad a muestras de modelos animales, alta sensibilidad, especificidad y alto rendimiento. En particular, el uso extensivo de la ionización por electrospray ha llevado a una mejora en el rendimiento de la EM para el análisis de lípidos. La mejora de los analizadores de masas en los espectrómetros de masas, incluyendo la combinación de diferentes analizadores de masas, ha añadido ventajas adicionales y el desarrollo de un analizador de masas de alta resolución ha revivido los estudios de lípidos11. El análisis basado en MS caracteriza las moléculas de lípidos de dos maneras principales: (1) Lipidómica de arriba hacia abajo, donde los experimentos de MS tienen como objetivo la caracterización cuantitativa rápida de los cambios globales dentro del lipidoma y se basan únicamente en masas precisas de precursores de lípidos intactos12; (2) Lipidómica ascendente que cuantifica especies moleculares individuales mediante la detección de iones de fragmentos estructurales característicos utilizando MS13,14 en tándem.

En general, el análisis de los lípidos en los fotorreceptores de Drosophila consta de dos pasos: en primer lugar, la extracción de los lípidos del tejido ocular/craneal y, en segundo lugar, el análisis de los lípidos extraídos por EM. Esto se puede realizar utilizando uno de los siguientes métodos: separación de lípidos por cromatografía líquida (LC) acoplada a MS o sin separación cromatográfica mediante lipidómica de escopeta/MS de infusión directa (DIMS). Ambos enfoques de perfil lipídico se basan en el uso de la ionización por electrospray MS (ESI-MS) y han demostrado ser sensibles, cuantitativos y eficientes 10,15. En el análisis DIMS, la identificación de lípidos se basa en la masa de iones precursores, exploraciones de pérdida neutra y firmas específicas de la clase de lípidos 14,16,17,18. Si bien este enfoque combina la velocidad de análisis y la robustez, no se puede evitar la supresión iónica de lípidos de baja abundancia debido a la presencia de lípidos de alta abundancia y altamente polarizables en la muestra. Así, los lípidos poco abundantes, como los fosfoinositidos y el PA, a menudo no son detectados o son mal detectados por las plataformas DIMS estándar, debido a la supresión de iones, entre otras razones,19,20. La separación por cromatografía líquida antes de la MS (LC-MS) puede ayudar a superar la supresión de iones, así como a centrar el análisis de clases o especies específicas de lípidos de interés21.

En este artículo se describen los pasos necesarios para cuantificar los principales lípidos de interés en los fotorreceptores de Drosophila. A este respecto, se han optimizado tres enfoques diferentes de EM: (1) DIMS utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución, (2) cromatografía líquida de fase inversa-MS (RPLC-MS) utilizando un espectrómetro de masas triple cuádruple, y (3) cromatografía líquida en fase normal-monitorización de reacciones múltiples-escaneo iónico de producto mejorado (MS (NPLC-MRM-EPI-MS) utilizando un espectrómetro de masas cuádruple triple con una función de escaneo iónico de producto mejorada. La elección entre estos métodos está dictada por las preguntas de investigación específicas que se están investigando. Para una descripción y análisis global de todos los tipos de glicerofosfolípidos implicados en la fototransducción, se debe utilizar DIMS. Sin embargo, cabe señalar que en este enfoque no es probable que se detecten glicerofosfolípidos de baja polarización y baja abundancia, como los fosfoinositidos22. Para detectar estos lípidos de baja abundancia, se debe realizar una RPLC-MS posterior a la derivatización. Utilizando este enfoque, hemos detectado y cuantificado con éxito el ácido fosfatídico (PA)23,24,25, el fosfatidilinositol (PI), el fosfatidilinositol 5 fosfato (PI5P)26, el fosfatidilinositol 4 fosfato (PI4P) y el PI(4,5)P 2 27. Los métodos DIMS y RPLC-MS posteriores a la derivatización generan información a nivel de clase de lípidos. Por ejemplo, utilizando estos dos métodos se puede cuantificar PA (34:2) cuyo m/z es consistente con múltiples especies moleculares, incluyendo: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) y (viii) PA (20:0/14:2). Con estos métodos, no se puede obtener información sobre la composición de la cadena de acilo graso del PA (34:2) presente en la muestra. Este desafío se puede superar mediante un método de MS híbrido que combina la separación de LC, el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) y el escaneo de iones de producto (EPI) mejorado. Este método es a la vez sensible y cuantitativo y permite: la medición directa, es decir, sin ningún pre-etiquetado o post-procesamiento de la muestra, y establece las especies moleculares con información exacta de la cadena grasa de acilo25. Utilizando este método, hemos identificado un gran número de especies moleculares de PA y hemos determinado la composición exacta de las cadenas de acilo graso en SN1 y SN2 de la columna vertebral de glicerol. Este enfoque será útil cuando se analice la función de especies moleculares específicas de cualquier clase de lípidos en los fotorreceptores. Los protocolos detallados presentados aquí para cada uno de estos tipos de análisis se pueden adaptar a otros lípidos de señalización relevantes para la función del fotorreceptor de Drosophila (para ver los esquemas, véase la Figura 1). Cabe señalar que los métodos detallados para el análisis lipidómico de varias otras clases de lípidos (no tratados en este artículo) se han descrito en otra parte. Estos incluyen ceramidas28,29, esfingolípidos30,31, lípidos neutros como diglicéridos y triglicéridos32,33 y esteroles15,33. En algunos casos, se han descrito métodos para el análisis de estos lípidos en tejidos de larvas de Drosophila y podrían adaptarse para su uso en fotorreceptores.

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Protocolo

1. Cría de moscas y preparación de productos químicos

  1. Moscas traseras (Drosophila melanogaster) en alimento estándar para moscas en una incubadora con 50% de humedad relativa a 25 °C sin iluminación interna. Prepare el alimento para moscas agregando 80 g/L de harina de maíz, 20 g/L de D-glucosa, 40 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 15 g/L de extracto de levadura, 4 mL de ácido propiónico, 0,7 g/L de TEGO (hidroxibenzoato de metilo) y 0,6 mL de ácido ortofosfórico como se describe en34 y también están disponibles en https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Cultive un conjunto de moscas, después de las eclosiones, en una incubadora enfriada mantenida a 25 °C con una iluminación continua de luz blanca de ~2.000 lux.
  2. Prepare el tampón de elución de fosfoinositida (PEB) agregando cloroformo: metanol: ácido clorhídrico 2,4 M en una proporción de 250:500:200 (vol/vol/vol). Prepare el tampón de lavado de fase inferior (LPWS) agregando metanol: ácido clorhídrico 1 M: cloroformo en una proporción de 235:245:15 (vol/vol/vol). Prepare la solución de lavado posterior a la derivatización agregando cloroformo:metanol:agua en una proporción de 8:4:3 (vol/vol/vol).
    NOTA: Utilice solventes y productos químicos de grado MS. No almacene el tampón PEB y LPWS durante más de 3 meses.
  3. Utilice la columna C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) para los fosfoinositidos, PI4P y PI(4,5)P2 y la columna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) para PA, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilinositol (PI). Para el método NPLC-MRM-EPI, utilice la columna de sílice (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Prepare el eluyente A agregando hexano:alcohol isopropílico:acetato de amonio acuoso de 100 mM en una proporción de 68:30:2 (vol/vol/vol) y el eluyente B agregando hexano:alcohol isopropílico:acetato de amonio acuoso de 100 mM en una proporción de 70:20:10 (vol/vol/vol) para PA, PC y PI. Prepare el disolvente A para fosfoinositidos añadiendo ácido fórmico al 0,1% en agua y el disolvente B añadiendo ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo.

2. Aislamiento de tejido

  1. Recoja 10 moscas por muestra con anestesia de dióxido de carbono (CO2) (las moscas se inmovilizan en segundos) y decapite las moscas con una cuchilla afilada en una placa anestésica de CO2 .
  2. Recoja moscas adaptadas a la oscuridad o a la luz de edad definida (12-24 h de edad) en tubos de 1,5 ml y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Deshidratar las moscas en acetona a -80 °C durante 48 h en un vial de vidrio35. Para el tejido de la retina, recolecta 100 retinas de moscas liofilizadas. Con un bisturí, retira los ojos del resto de la cabeza y saca la retina.
  3. Para el análisis de fosfoinositidos PI4P y PI(4,5)P2 , cuando se trabaje con retinas frescas, se utilizarán 25 retinas por muestra de moscas cultivadas en condiciones de iluminación adecuadas para medir los niveles de lípidos durante la iluminación y de moscas cultivadas sin luz para medir los niveles de lípidos en la oscuridad. Almacene en 50 μL de 1x PBS en tubos homogeneizadores sobre hielo seco hasta que esté listo para la extracción.

3. Extracción de lípidos

PRECAUCIÓN: El cloroformo es un solvente tóxico y es cancerígeno por naturaleza. Afecta al sistema reproductivo y es irritante para la piel y los ojos. Se debe tener precaución al manipular este producto químico. Todos los pasos relacionados con el cloroformo deben realizarse en una campana química bien ventilada.

  1. Para todos los glicerofosfolípidos distintos de PI4P y PI(4,5)P2
    1. Para cada muestra, homogeneizar 10 cabezas de mosca o 100 retinas (recogidas como se describe en el paso 2.2) en 0,1 mL de HCl metanólico helado 0,1 N y 30 μL de mezcla patrón interna (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), ácido lisofosfatídico (LPA; 13:0), lisofosfatidilcolina (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) y PC (12:0/13:0)). Prepare patrones de tal manera que la cantidad final de cualquier patrón lipídico caiga dentro de la curva de respuesta lineal del espectrómetro de masas.
    2. Homogeneizar los tejidos mediante un homogeneizador automatizado que permite un tratamiento rápido y simultáneo de todas las muestras. Haga girar brevemente los tubos en una centrífuga de mesa y asegúrese de que no se forme ningún gránulo, lo que indica una homogeneización completa. Transfiera el homogeneizado metanólico a un tubo de microcentrífuga tapado de 2 mL.
    3. Agregue 0,2 mL de HCl metanólico 0,1 N helado para recuperar cualquier material residual en el tubo y combínelo en el tubo de 2 mL. Añadir 0,1 mL de HCl metanólico helado 0,1 N seguido de 0,8 mL de cloroformo y mezclar bien. Deje reposar la mezcla, que contiene homogeneizado de tejido, sobre hielo durante 10 minutos y luego agregue 0,4 ml de KCl al 0,88% y vórtice durante 30 s.
    4. Centrifugar la mezcla a 1.000 x g durante 10 min a 4 °C para separar las fases acuosa y orgánica. Extraiga la fase orgánica inferior que contiene lípidos con mucho cuidado sin mezclarla con la fase acuosa y transfiérala a un tubo de microcentrífuga fresco de 2 mL.
      NOTA: Durante la extracción de lípidos, transfiera la fase orgánica inferior con sumo cuidado para evitar mezclarla con la fase acuosa, lo que puede dificultar el análisis de lípidos posterior.
    5. Seque esta solución lipídica en un evaporador al vacío a 4 °C, inspeccione visualmente la muestra para garantizar un secado completo. Vuelva a suspender en 420 μL de mezcla de metanol:cloroformo 2:1 para su análisis. Analice las muestras inmediatamente sin almacenamiento.
  2. Para fosfoinositidos PI4P y PI(4,5)P2
    1. Homogeneizar 25 retinas en 950 μL de tampón de elución de fosfoinositida (PEB; 250 mL de CHCl3, 500 mL de metanol y 200 mL de HCl 2,4 M) y añadir patrones internos (fosfatidiletanolamina (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); y PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) mezcla que contiene 50 ng de PI, 25 ng de PI4P, 50 ng de PI(4,5)P2 y 0,2 ng de PE por muestra.
    2. Añadir 250 μL de cloroformo y 2,4 M de HCl, seguido de la sonicación durante 2 min y la centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C para la separación de fases. Extraiga la fase orgánica inferior en un tubo nuevo, lave con 900 μL de LPWS y centrifugue a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Extraiga los lípidos de la fase acuosa restante realizando una vez más una separación de fases como en el paso 3.2.2. Seque las fases orgánicas recolectadas en una centrífuga al vacío configurada a 4 °C, inspeccione visualmente las muestras para garantizar un secado completo.

4. Ensayo de fosfato orgánico

  1. Hacer una solución madre de 7,34 mM KH2PO4. Realizar las diluciones estándar, utilizando agua destilada, en tubos de microcentrífuga según la Tabla 1. Agite ligeramente los tubos y transfiera las diluciones estándar a tubos de vidrio sin fosfatos.
  2. Prepare un juego separado de tubos de vidrio que contengan las muestras de lípidos. Optimice el volumen de las muestras de lípidos de modo que la absorbancia a 630 nm (después de completar este protocolo) se encuentre dentro del rango del estándar KH2PO4 (que es de 0 a 20x).
  3. Calentar los tubos de vidrio que contienen diluciones estándar a 120 °C hasta que queden completamente secos. Calentar lostubos de vidrio que contienen las muestras de lípidos (tomar 1/8 del volumen total de la muestra necesario para tener una absorbancia dentro del rango del estándar KH2PO4) a 90 °C hasta que se seque por completo.
  4. Añadir 50 μL de ácido perclórico al 70% a todos los tubos y calentar a 180 °C durante 30 min. Enfríe los tubos a temperatura ambiente. Añadir 250 μL de agua, 50 μL de molibdato amónico al 2,5% y 50 μL de ácido ascórbico al 10% a cada tubo.
    NOTA: 2,5% de molibdato de amonio y 10% de ácido ascórbico son concentraciones de peso/vol. Deben estar recién hechos y se pueden almacenar a 4 °C hasta por 1 semana.
  5. Mantenga los tubos en una incubadora agitadora a 37 °C durante 1 h. Aliquot 130 μL de muestra en una placa de 96 pocillos y mida la absorbancia a 630 nm utilizando un espectrofotómetro.

5. Derivatización

PRECAUCIÓN: Se ha reportado que el trimetilsilildiazometano (TMSD) tiene muchos efectos toxicológicos en los seres humanos. La TMSD en solución se dirige a los riñones, el hígado, el tracto gastrointestinal, los músculos esqueléticos, el sistema nervioso central y los sistemas respiratorio y reproductivo. Se deben tomar precauciones extremas al manipular este producto químico. Todo el proceso debe realizarse en una campana química bien ventilada.

  1. A la fase orgánica inferior de las muestras obtenidas a partir del final del paso 3.2.3., añadir 50 μL de TMSD 2 M. Deje que la reacción continúe a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación constante a 250 rpm. Después de 10 min, agregue 10 μL de ácido acético glacial para apagar la reacción, indicada por la desaparición del color amarillo en la solución.
  2. Golpee los tubos y ábralos con cuidado para eliminar el N2 formado en la reacción de enfriamiento. Después de que el gas N2 haya escapado, cierre los tubos y gírelos hacia abajo. A continuación, añadir 600 μL de solución de lavado post-derivatización y vórtice durante 2 min en una batidora a 250 rpm.
  3. Deseche ~ 400 μL de la fase superior que se formará. Repita el paso 5.2. Deseche toda la fase superior y agregue 50 μL de metanol al 90% a la fase inferior y mezcle.
  4. Secar las muestras durante 2 h en un concentrador centrífugo a 800 x g operando en vacío. Después del secado, los tubos deben contener ~ 20 μL de la muestra restante. Añadir 180 μL de metanol al 100%, mezclar bien y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2-3 días antes de la LC-MS/MS.

6. Adquisición y análisis de datos

  1. Adquisición de datos en MS de infusión directa (DIMS)
    NOTA: La EM se puede realizar por infusión directa o por cromatografía líquida MS (LC-MS). En esta sección, describimos la EM basada en infusión directa.
    1. Antes de comenzar el experimento, calibre el espectrómetro de masas según las instrucciones del fabricante.
    2. Genere una curva de respuesta lineal para la serie de dilución de patrones sintéticos y, en función de la respuesta lineal del instrumento, diluya la muestra de modo que la intensidad del analito lipídico quede dentro de la linealidad del instrumento. Diluir extractos de lípidos totales o patrones lipídicos con una mezcla de metanol:cloroformo 2:1 (vol/vol). Seleccione la dilución de los extractos lipídicos totales y los patrones sintéticos individualmente para cada experimento.
    3. Transfiera los extractos y los patrones a viales individuales. Evite las burbujas de aire durante la transferencia de muestras a viales de muestra de MS. Las burbujas de aire crearán una alta presión en la columna y dificultarán el análisis de lípidos.
    4. Antes del análisis, centrifugar las muestras durante 9 minutos a 6.440 x g y cargarlas en una placa de 96 pocillos y sellarlas con papel de aluminio.
    5. Realice análisis de MS en un espectrómetro de masas de alta resolución utilizando el método de infusión directa. Logre una ionización estable de glicerofosfolípidos basada en ESI utilizando una fuente robótica de iones de nanoflujo utilizando chips con boquillas de pulverización de 4,1 μm de diámetro.
    6. Controle la fuente de iones utilizando un software de espectrómetro de masas personalizado y establezca los voltajes de ionización a +1,2 kV y -1 kV en modos positivo y negativo, respectivamente; contrapresión a 1 psi en ambos modos; y temperatura capilar de transferencia iónica a 180 °C. Realice la adquisición con una resolución de masa, Rm/z400 = 100.000. Consulte la Figura 2A para ver la interfaz del software para configurar los parámetros del espectrómetro de masas.
    7. Vuelva a disolver los extractos lipídicos totales secos en 400 μL de cloroformo:metanol (1:2). Para el análisis, cargue 60 μL de muestras en una fuente de iones de placa de 96 pocillos y selle con papel de aluminio. Analice cada muestra durante 20 minutos en modo de iones positivos para detectar PC, fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolamina (PE), PE-O (fosfatidiletanolamina ligada al éter), ceramida (Cer) y ceramida fosfato (Cer-P).
    8. Realice una adquisición independiente en modo de iones negativos durante 20 minutos donde se detectaron PA y PI. Véase la Figura 2B para obtener detalles específicos de la configuración del instrumento para la adquisición de datos para EM de alta resolución y una lista específica de especies de PA que se han incluido en la configuración de la adquisición dependiente de datos (DDA).
      NOTA: La interfaz de software para configurar el método DDA se muestra en la Figura 2C. La lista de moléculas de PA objetivo de este enfoque se enumera en la Tabla 2. En la Figura 2D se muestra una captura de pantalla del resultado experimental en el enfoque de DDA.
  2. Análisis de datos en EM de infusión directa (DIMS)
    NOTA: El análisis de los datos de masas generados por todos los tipos de espectrómetros de masas requiere una plataforma automatizada de análisis de lípidos. LipidXplorer36 es un software no comercial que admite todo tipo de experimentos de lípidos DIMS. Este software se puede encontrar aquí: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Una vez que los datos se hayan adquirido utilizando los métodos descritos en el paso 6.1, identifique las especies de lípidos utilizando una plataforma de análisis de lípidos haciendo coincidir m/z de sus picos monoisotópicos con las restricciones de composición elemental correspondientes. El ejemplo de importación de datos se muestra en la Figura 3A. Establezca la tolerancia de masa en 10 ppm y el umbral de intensidad de acuerdo con el nivel de ruido informado por el software del espectrómetro de masas.
    2. Después de importar, compile las consultas del lenguaje de consulta de fragmentación molecular (MFQL) para PA en función de la estructura química de PA, que se muestra en la figura 3B. Consulte la Figura 3C para ver la configuración de MFQL en la plataforma de análisis de lípidos.
    3. Utilizando un enfoque similar, compile MFQL para otros glicerofosfolípidos en el software de la plataforma de análisis de lípidos. Cada consulta se dirige a una clase de lípidos y se pueden usar muchas consultas en una sola ejecución.
    4. Ejecute todas las MFQL haciendo clic en el botón Ejecutar . Todas las especies lipídicas identificadas se reportan en un único archivo de resultados en formato de .csv con las abundancias de los correspondientes iones precursores y/o fragmentarios para la posterior cuantificación de lípidos. En el Cuadro 3 se da un ejemplo de este resultado.

7. Cromatografía líquida y MS en tándem de muestras derivatizadas

  1. Separe las muestras obtenidas del paso 5.4 mediante cromatografía líquida utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento. Al elegir este sistema, asegúrese de que su software pueda integrarse con el del espectrómetro de masas utilizado para el análisis.
  2. Conecte el sistema a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. Elija una columna de separación. Para la separación de lípidos distintos de PI4P y PI(4,5)P2 , elija una columna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Para PI4P y PI(4,5)P2, elija una columna C4 de dimensiones 300 Å (1,0 mm x 100 mm x 1,7 μm).
  3. Prepare la fase móvil que contiene formiato de amonio disolviendo primero el formiato de amonio en agua de grado de especificación de masa y luego en solventes orgánicos. Sonicar todos los disolventes que se utilizan en la espectrometría de masas durante 20 min para eliminar las burbujas de aire.
  4. Equilibrar la columna infundiendo la solución A que contiene agua + 0,1% de ácido fórmico y la solución B que tiene acetonitrilo + 0,1% de ácido fórmico.
  5. Inyecte el eluido del sistema de cromatografía líquida (volumen de inyección en el rango de 1-20 μL) en el espectrómetro de masas para su análisis. Ajuste el caudal a 0,1 mL/min y la temperatura de la columna a temperatura ambiente. Inyecte todo el volumen de eluido que sale de la columna en el espectrómetro de masas.
  6. En la secuencia de inyección de muestras, comience siempre con una inyección de solvente en blanco (metanol) y mantenga las muestras estándar ordenadas de forma intermitente entre las muestras biológicas para los controles de control de calidad de la espectrometría de masas (cada sexta ejecución).
  7. Para la configuración experimental del espectrómetro de masas de trampa de iones triple cuadrupolo híbrido, antes de comenzar el experimento, calibre el espectrómetro de masas según las instrucciones del fabricante. Para PA, PC y PI, utilice la ionización por electrospray (ESI) para generar los iones y opere en modo positivo para detectar las especies de lípidos cargadas positivamente. Adquiera los datos y analícelos utilizando el software de análisis de datos instalado con el sistema.
  8. Optimice los parámetros para el análisis de acuerdo con el estándar interno correspondiente utilizado. Los parámetros del espectrómetro de masas son los siguientes: tiempo de permanencia = 30 ms; CAD (disociación activada por colisión) = 3 psi; GS1 (gas fuente 1) = 24 psi y GS2 (gas fuente 2) = 21 psi; CUR (gas de cortina) = 30 psi; IS (tensión ESI) = 4,5 kV; y TEM (temperatura de la fuente) = 450 °C.
  9. Para PI4P y PI(4,5)P2, utilice el espectrómetro de masas en modo positivo. Los parámetros del espectrómetro de masas son los siguientes: tiempo de permanencia = 65 ms; CAD (disociación activada por colisión) = 2 psi; GS1 (gas fuente 1) y GS2 (gas fuente 2) = 20 psi; CUR (gas de cortina) = 37 psi; IS (tensión ESI) = 5,2 kV; y TEM (temperatura de la fuente) = 350 °C.

8. Cromatografía líquida de fase normal-monitoreo de reacción múltiple-escaneo iónico de producto mejorado MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Condiciones cromatográficas
    1. Utilice un método de LC de fase normal utilizando una columna de sílice, que es capaz de separar el PA de otros fosfolípidos. Utilice hexano:alcohol isopropílico:100 mM NH4COOH acuoso en la proporción 68:30:2 como fase móvil A y alcohol isopropílico:hexano:100 mM NH4COOH acuoso en una proporción 70:20:10 como fase móvil B.
      NOTA: Esta combinación proporcionó la mejor separación y selectividad máxima de diferentes especies moleculares de PA.
    2. Utilice el comportamiento cromatográfico de los compuestos de referencia (patrones internos), en términos de resolución y forma de pico, para elegir las condiciones óptimas.
    3. Realice la separación cromatográfica en una columna de sílice de fase normal (1 mm x 150 mm x 3 μm) a temperatura ambiente en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento. Ajuste el volumen de inyección del muestreador automático a 6 μL y el caudal de eluyente a 210 μL/min.
    4. Después de 5 minutos de equilibrio con el 100% de la fase móvil A, aumente linealmente la fase móvil B al 30% durante 5 minutos, luego al 80% durante 5 minutos, luego al 100% durante 5 minutos, y manténgala constante al 100% durante 5 minutos. Por último, vuelva a equilibrar la columna durante 9 min.
  2. Espectrometría de masas
    1. Utilice un espectrómetro de masas híbrido de trampa de iones de triple cuadrupolo que funcione en modo ESI negativo. Controle el funcionamiento del sistema y la adquisición de datos utilizando el software de análisis proporcionado. Antes de comenzar el experimento, calibre el espectrómetro de masas según las instrucciones del fabricante.
    2. Optimice los parámetros de la fuente mediante el análisis de inyección de flujo de la mezcla estándar interna. En consecuencia, configure el voltaje de pulverización de iones = -4,5 kV, la temperatura de la fuente (TEM) = 450 °C, el gas de disociación activado por colisión (CAD) = 3 psi. Utilice gas nitrógeno como gas de colisión y configure el gas del nebulizador (GS1) = 24 psi, el gas auxiliar (GS2) = 21 psi y el gas de cortina (CUR) = 30 psi.
    3. Establezca los parámetros de la ruta del ion dependiente del compuesto como potencial de desagrupación (DP) = -42 V, potencial de entrada (EP) = -6 V y potencial de salida de la celda de colisión (CXP) = -12 V, optimizado mediante la infusión continua de una solución de mezcla estándar interna. Registre espectros completos del producto junto con transiciones MRM de precursor a producto con energía de colisión variable (CE) a partir de 12 eV a 40 eV para el análisis de fragmentación utilizando la función de escaneo EPI disponible en el espectrómetro de masas.
      NOTA: El EPI basado en IDA activado por MRM registra simultáneamente el producto ionario precursor, el escaneo de iones y la adquisición MS/MS sobre la marcha. El MRM redujo el rango de escaneo iónico en el cuadrupolo 1 (Q1) y la trampa de iones mejoró los fragmentos de iones que pasan a través de Q2, mejorando así en gran medida la capacidad cualitativa del cuadrupolo MS / MS, especialmente para la captura de todos los fragmentos que surgen del ion precursor. En el modo EPI, se detectan múltiples iones de fragmentos que surgen de los iones precursores en Q3 con una mejor relación señal-ruido.
    4. Realice experimentos de MRM con CE de 39 eV para obtener una alta sensibilidad. Limite el número máximo de MRM a 75 y el tiempo de permanencia a 30 ms para detectar y registrar el MRM de cualquier molécula específica que eluya de la columna cromatográfica en cualquier momento durante la ejecución. Esto aumenta el ciclo de trabajo de la máquina.
    5. Realice un ajuste experimental para decidir los mejores parámetros de ionización para PA, como se describe anteriormente. Para este experimento, ajuste el voltaje de pulverización de iones = -4,5 kV, la temperatura de la fuente (TEM) = 450 °C, el gas de disociación activado por colisión (CAD) = 3 psi. Utilice el gas nitrógeno como gas de colisión. Establezca el gas del nebulizador (GS1) = 24 psi, el gas auxiliar (GS2) = 21 psi y el gas de cortina (CUR) = 30 psi.
    6. Examine manualmente todos los datos de ajuste para garantizar la selección adecuada de los parámetros de ionización y los iones del producto. Tenga en cuenta la minimización de la interferencia potencial entre los canales MRM al seleccionar el ion producto. Los parámetros experimentales utilizados para el análisis de todas las especies moleculares de PA se muestran en la Tabla 4.
      NOTA: El espectrómetro de masas de trampa de iones lineal híbrido de triple cuadrupolo nos permite combinar el modo de escaneo MRM con la función de escaneo de trampa de iones, lo que permite un escaneo rápido y alto mediante la utilización de métodos como el escaneo EPI para registrar espectros de masas en tándem útiles de cada precursor detectado. En este estudio, para identificar distintas especies moleculares de PA, hemos explotado este enfoque MS/MS basado en MRM-EPI basado en la ruta convencional de iones de triple cuadrupolo con la propiedad de escaneo EPI de la trampa de iones, controlada por el software de análisis.

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Resultados

Determinación de la linealidad de la medición en MS. La linealidad es la capacidad del método MS para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito lipídico. La linealidad depende de (a) la eficiencia de ionización del analito lipídico y (b) el comportamiento de ionización del analito lipídico a diferentes concentraciones depende de la fuente de iones utilizada. En la ionización por electrospray (ESI) que se utiliza en este estudio, la linealidad se mantiene a...

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Discusión

Una serie de líneas de evidencia convergen en múltiples roles de los lípidos de señalización en la regulación de la organización y función de los fotorreceptores de Drosophila. Además del papel bien estudiado de los lípidos en la regulación de la fototransducción3, los lípidos de señalización también se han implicado en el tráfico de proteínas y la organización subcelular 23,30,39,40,41.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por el Departamento de Energía Atómica del Gobierno de la India (Identificación del Proyecto No. RTI 4006), el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India (BT/PR4833/MED/30/744/2012) y una beca senior de la Alianza de la India (IA/S/14/2/501540) a PR. Agradecemos al Centro de Espectrometría de Masas del NCBS, especialmente al Dr. Dhananjay Shinde y a los miembros del laboratorio de relaciones públicas por sus contribuciones al desarrollo de estos métodos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HCL metanólico 0,1 N Para elaislamiento total de lípidos
0,88% KClSigma AldrichP9541Para el aislamiento total de lípidos
1,5 ml / 2ml LoBind Tubos EppendorfEppendorf,022431081/022431102Para el aislamiento total de lípidos
2.3.18 16:0/18:1 Diether PELípidos polares Avanti999974Estándar interno de lípidos
37% HCl puroSigma Aldrich320331Para el aislamiento total de lípidos Placa
de 96 pocillos Ensayo defosfato orgánico total
AcetonaFisher Scientific32005Para disecciones
molibdatoFosfato orgánico total
ascórbicoFosfato orgánico total
Sonicadorde baño
Columna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352
PortacuchillasFine Scientific Tools10052-11Para disecciones
IncubadoraDBO Ensayo de fosfato orgánico total
Cuchillas rompiblesFine Scientific tools10050-00Para disecciones
Papel mantequillaGE healthcare10347671Para disecciones
C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] columnaWaters India Pvt. Ltd.186004623
LC Cromatografía Viales de vidrio de color ámbar con insertosMerck27083-U
d18:1/17:0)Lípidos polares Avanti860517Patrón interno de lípidos
d5-Fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Lípidos polares Avanti850172Patrón interno de lípidos
Microscopiosde disecciónOlympusSZ51Para disecciones
Baño de calor seco.
Eluyente AHexano:Alcohol isopropílico:100 mM acetato de amonio acuoso (68:30:2) , para LC
Eluyente BHexano:Alcohol isopropílico:100 mM acetato acuoso de amonio (70:20:10), para LC
Papel de filtroIndica-HM274039Para
disecciones MatracesBorosilPara disecciones
MoscasNANARaghu Padinjat lab
Alimento para moscasNANANCBS lab kitchen, composición: harina de maíz 80 g/L, D-glucosa 20 g/L, sacarosa 40 g/L, agar 8 g/L, extracto de levadura 15 g/L, ácido propiónico 4 mL, TEGO (metil para hidroxibenzoato) 0,7 g/L, ácido ortofosfórico 0,6 mL)
PinzasFine Scientific Tools11254-20Para disecciones
Embudo de campana
BorosilPara disecciones
Ácido acético glacialFisher ScientificA35-500Para derivatización
Frascos de vidrio: transparente y colorPara el aislamiento total
de lípidos Tubos de vidrio sin fosfatos resistentes a altas temperaturas.Ensayo de fosfato orgánico total
Tubos de homogeneización con perlasPara el aislamiento total de lípidos
Instrumento homogeneizadorPrecellys
CO2 conectado a las almohadillas para moscasPara empujar moscas
Incubadoras controladas por iluminaciónPanasonic SanyoMIR-553Para mosca cría
Mezclametanol:cloroformo (2:1), Para el aislamiento total de lípidos
Grado LC-MS CloroformoSigma Aldrich650498Para el aislamiento total
de lípidos Grado LC-MS MetanolSigma Aldrich34860Para el aislamiento total de lípidos
Agua de grado LC-MSSigma Aldrich34877Para un aislamiento total de lípidos
Ligero medidorHTC instrumentsLX-103
Puntas de baja retenciónEppendorf0030072006/72014/72022/72030Para el aislamiento total de lípidos
Instrumento LTQ Orbitrap XLThermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania
Ácido lisofosfatídico (LPA)- 13:0Lípidos polares AvantiLM-1700Lípidos Estándar interno
Ácido lisofosfatídico (LPA)- 17:1Lípidos polares AvantiLM 1701Lípidos Estándar
Interno Lisofosfatidilcolina (LPC) -13:0Lípidos polaresAvanti LM-1600Lípidos Estándar Interno
Lisofosfatidilcolina (LPC) -17:1Lípidos polares Avanti855677Lípidos Estándar Interno
Lisofosfatidilcolina (LPC)- 19:0Lípidos polares Avanti855776Patrón
Ácido perclórico.Ensayo de fosfato orgánico total
Fosfato estándar de fosfato dihidrógenoEnsayo de fosfato orgánico total
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)NANAComposición: 137 mMNaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 y 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4
Ácido fosfatídico (PA) - 12:0/13:0Lípidos polares de Avanti, LM-1400  Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)- 17:0/14:1Lípidos polaresAvanti LM-1404Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)-(17:0/17:0)Lípidos polares Avanti830856Lípidos Estándar Interno
Ácido fosfatídico (PA)-16:0-D31/18:1Lípidos polares860453Pídidos Estándar
Interno Fosfatidilcolina (PC) -12:0/13:0Lípidos polares AvantiLM-1000Pípidos Estándar Interno
Fosfatidilcolina (PC) - 17:0/14:1Lípidos polaresLM-1004Lípidos Estándar Interno
Fosfatidiletanolamina (PE) - 17:0/14:1Lípidos polares AvantiLM-110Pípidos Estándar Interno
Fosfatidilinositol (PI) - 17:0/14:1Lípidos Avanti Estándar Interno LípidosLM-1504Lípidos
Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Lípidos polares AvantiLM-1904Lípidos Estándar Interno
Fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) - 17:0/20:4Lípidos polares AvantiLM-1901Estándar Interno de Lípidos
Fuente robótica de iones de nanoflujoTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, EE. UU.)
Rotospin instrumentoTarsons3090X
Almohadillas desilicona Para disecciones
disolvente A0,1% ácido fórmico en agua, para
LC disolvente B0,1% ácido fórmico en acetonitrilo, para LC
Centrífuga
Termomezclador
TMS-diazometanoAcrosAC385330050Para derivatización
Espectrómetro de masas de triple cuadrupoloAB SciexQTRAP 6500
Sistema UPLCWaters Acquity
Concentrador centrífugo de vacíoScanvac , Labogene
Máquina
Ensayo de de amonio Ensayo de ácido LC de extractora ámbar de óxido de circonio orgánica inicial Interno de Lípidos de potasio de sobremesa de vórtice

Referencias

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

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