Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

Resumen

Los mapas crio-EM de alta resolución de macromoléculas también se pueden lograr mediante el uso de microscopios TEM de 200 kV. Este protocolo muestra las mejores prácticas para establecer alineaciones ópticas precisas, esquemas de adquisición de datos y selección de áreas de imágenes que son esenciales para la recopilación exitosa de conjuntos de datos de alta resolución utilizando un TEM de 200 kV.

Resumen

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha establecido como un método de rutina para la determinación de la estructura de proteínas durante la última década, tomando una parte cada vez mayor de los datos estructurales publicados. Los recientes avances en la tecnología TEM y la automatización han aumentado tanto la velocidad de recopilación de datos como la calidad de las imágenes adquiridas, al tiempo que disminuyen el nivel requerido de experiencia para obtener mapas crio-EM a resoluciones inferiores a 3 Å. Si bien la mayoría de estas estructuras de alta resolución se han obtenido utilizando sistemas crio-TEM de 300 kV de última generación, las estructuras de alta resolución también se pueden obtener con sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente cuando están equipadas con un filtro de energía. Además, la automatización de las alineaciones del microscopio y la recopilación de datos con la evaluación de la calidad de la imagen en tiempo real reduce la complejidad del sistema y garantiza una configuración óptima del microscopio, lo que resulta en un mayor rendimiento de imágenes de alta calidad y un rendimiento general de la recopilación de datos. Este protocolo demuestra la implementación de los recientes avances tecnológicos y características de automatización en un microscopio electrónico de criotransmisión de 200 kV y muestra cómo recopilar datos para la reconstrucción de mapas 3D que son suficientes para la construcción de modelos atómicos de novo . Nos centramos en las mejores prácticas, las variables críticas y los problemas comunes que deben considerarse para permitir la recopilación rutinaria de dichos conjuntos de datos crio-EM de alta resolución. En particular, se revisan en detalle los siguientes temas esenciales: i) automatización de alineaciones de microscopios, ii) selección de áreas adecuadas para la adquisición de datos, iii) parámetros ópticos óptimos para la recopilación de datos de alta calidad y alto rendimiento, iv) ajuste del filtro de energía para imágenes de pérdida cero, y v) gestión de datos y evaluación de calidad. La aplicación de las mejores prácticas y la mejora de la resolución alcanzable utilizando un filtro de energía se demostrará en el ejemplo de apo-ferritina que se reconstruyó a 1,6 Å, y thermoplasma acidophilum 20S proteasoma reconstruido a resolución 2,1-Å utilizando un TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo.

Introducción

La determinación de la estructura de la proteína es fundamental para comprender la arquitectura molecular, la función y la regulación de los complejos de proteínas involucrados en procesos celulares clave, como el metabolismo celular, la transducción de señales o las interacciones huésped-patógeno. La microscopía crioelectrónica (crio-EM) ha surgido como una técnica poderosa capaz de resolver la estructura 3D de muchas proteínas y sus complejos que eran demasiado desafiantes para las técnicas estructurales tradicionales, como la difracción de rayos X y la espectroscopia de RMN. En particular, se ha demostrado que el crio-EM es el método de elección para las proteínas de membrana, que no se pueden cristalizar fácilmente o preparar en cantidades suficientes para las técnicas estructurales tradicionales, y proporcionó nuevos conocimientos sobre la estructura y función de importantes receptores celulares y canales iónicos 1,2,3,4,5 . Más recientemente, la crio-EM ha desempeñado un papel importante en la lucha contra la pandemia de Covid-19 al determinar el mecanismo de infección por SARS-CoV-2 a nivel molecular, que dilucidó los orígenes de la enfermedad Covid-19 y proporcionó la base para el rápido desarrollo de vacunas y terapias eficientes 6,7,8,9,10.

Por lo general, los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) de 300 kV de alta gama se utilizan para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas mediante el análisis de partículas únicas (SPA) crio-EM para revelar su conformación e interacciones. Recientemente, la técnica SPA alcanzó una nueva frontera cuando la muestra común de crio-EM apo-ferritina se reconstruyó a resolución atómica (1.2 Å)^11,12 utilizando un TEM de 300 kV equipado con la pistola de emisión de campo frío (E-CFEG), un detector de electrones directo y un filtro de energía. En esta resolución, fue posible resolver inequívocamente las posiciones de los átomos individuales en la estructura, la conformación de las cadenas laterales de aminoácidos individuales, así como el enlace de hidrógeno y otras interacciones, lo que abre nuevas posibilidades para el descubrimiento de nuevos objetivos basados en la estructura y la optimización de los candidatos a fármacos existentes.

Los microscopios TEM de 200 kV de rango medio se utilizan a menudo para el cribado de muestras y la optimización de muestras antes de la recopilación final de datos de alta resolución utilizando los microscopios TEM de gama alta, particularmente en instalaciones crio-EM más grandes. Por lo general, las muestras con imágenes se pueden resolver en el rango de resolución de 3-4 Å que es suficiente para pasar a un TEM de 300 kV de gama alta para la recopilación final de datos. En consecuencia, la recopilación de datos utilizando el TEM de 200 kV a menudo no se optimiza aún más para obtener los resultados de mayor resolución posibles. Además, muchas preguntas biológicas interesantes ya pueden ser respondidas y publicadas a estas resoluciones, ya que todas las cadenas laterales de aminoácidos ya están resueltas, y la ocupación de los sitios de unión de ligandos también se puede determinar de manera confiable¹³. Ya se ha demostrado que los TEMs de 200 kV pueden alcanzar resoluciones superiores a 3 Å para numerosas muestras 14,15,16,17,18. Las imágenes tomadas a 200 kV exhiben un contraste inherentemente mayor de partículas fotografiadas, lo que incluso puede facilitar una alineación inicial más precisa de las partículas a pesar de una señal más atenuada a alta resolución en comparación con las imágenes TEM de 300 kV. Es importante tener en cuenta que la resolución alcanzada de los mapas crio-EM reconstruidos también está limitada por la flexibilidad estructural y la heterogeneidad conformacional de las muestras fotografiadas, lo que afecta tanto a las reconstrucciones de 200 kV como a las de 300 kV. De hecho, muchas más reconstrucciones crio-EM obtenidas utilizando los sistemas de 300 kV se resolvieron en el rango de resolución de 3-4 Å que en resoluciones más altas¹⁹. Como los microscopios TEM de 200 kV son menos complejos y caben en salas más pequeñas, estos microscopios representan una buena opción de menor costo para la determinación de la estructura de macromoléculas biológicas mediante crio-EM, al tiempo que preservan la automatización de largas colecciones de datos de múltiples muestras almacenadas dentro del sistema Autoloader del microscopio.

La recopilación de conjuntos de datos crio-EM para la determinación de estructuras de alta resolución requiere una alineación precisa de la óptica del microscopio. Las alineaciones de columna proceden sistemáticamente desde la fuente de electrones hasta el sistema de lentes del condensador, la lente del objetivo y el filtro de energía con un detector de electrones. Normalmente no se requiere la secuencia completa de alineaciones. Cuando es necesario, el usuario es guiado a través de procedimientos semiautomatizados con una descripción adecuada de cada paso en una ventana de ayuda sensible al contexto durante todo el procedimiento de alineación en la interfaz de usuario del microscopio (panel de control Alineaciones directas). Una vez que el microscopio está completamente alineado, la óptica electrónica permanece estable y las alineaciones no necesitan cambiarse durante al menos unos meses. Solo las alineaciones más sensibles, como la iluminación paralela del plano de muestra, el astigmatismo objetivo y la alineación libre de coma, deben refinarse justo antes de comenzar la recopilación de cada conjunto de datos. La calidad de los datos recopilados se puede monitorear durante la recopilación de datos utilizando diferentes paquetes de software, como EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live²⁰, Relion²¹, Scipion²², WARP²³ o Appion²⁴.

Además de las alineaciones precisas del microscopio, la alta calidad de las muestras bien purificadas con una heterogeneidad conformacional y compositiva mínima también es un requisito previo para la recopilación de conjuntos de datos de alta resolución y la resolución de estructuras de alta resolución. Se pueden encontrar más detalles sobre los protocolos típicos, los desafíos frecuentes y los posibles remedios en otras revisiones dedicadas a este tema 25,26,27. Esencialmente, es fundamental encontrar áreas en una cuadrícula crio-EM dada que tenga hielo lo suficientemente delgado como para preservar la información de alta resolución, y las partículas individuales se distribuyen densamente en orientaciones aleatorias sin superposiciones. Sin embargo, las rejillas crio-EM típicas tienen un espesor de hielo no uniforme y, por lo tanto, es importante encontrar y seleccionar las áreas óptimas para la obtención de imágenes. Diferentes medios para la estimación del espesor del hielo en la red están disponibles en paquetes de software dedicados a la recopilación automatizada de conjuntos de datos crio-EM, como EPU 2, Leginon²⁸ o SerialEM²⁹.

El advenimiento de detectores de electrones directos rápidos y sensibles permitió la recopilación de imágenes en muchas fracciones como películas que permitieron la compensación de los movimientos inducidos por el haz y dieron como resultado un aumento sustancial en la calidad y cantidad de datos utilizados en el procesamiento de imágenes y la reconstrucción final en 3D³⁰. Al mismo tiempo, la automatización y la recopilación de datos de alto rendimiento proporcionan enormes conjuntos de datos con miles de imágenes / películas que representan desafíos para el almacenamiento y el acceso a los datos. El modelo adoptado con grandes instalaciones de crio-EM que sirven a decenas a cientos de usuarios, especialmente requiere una gestión de datos organizada con un seguimiento adecuado y el intercambio de datos en tuberías de cryo-EM establecidas^31,32.

Este estudio describe un protocolo para la recolección rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando el microscopio TEM Glacios de 200 kV. Las alineaciones necesarias de la óptica del microscopio se describen junto con los procedimientos para la evaluación de muestras crio-EM y la selección de áreas adecuadas para la recopilación de datos de alta resolución. La organización de los datos recopilados y los metadatos relacionados con la información de muestra se demuestra en Athena, una plataforma de gestión de datos que facilita la revisión de la información de la muestra y los datos recopilados. Utilizando la muestra de apo-ferritina del ratón, fue posible lograr una reconstrucción 3D a una resolución de 1,6 Ź³. Utilizando el protocolo descrito, también reconstruimos el mapa de densidad 3D del proteasoma 20S de Thermoplasma acidophilum a una resolución de 2.1 Å.

Protocolo

Todos los pasos del protocolo se describen para el sistema TEM Glacios de 200 kV (denominado en lo sucesivo TEM de 200 kV) equipado con el filtro de energía Selectris-X (denominado en lo sucesivo filtro de energía) y el detector Falcon 4 (denominado en lo sucesivo detector de electrones directo). Los pasos del protocolo son específicos para la aplicación EPU, que es el software de recopilación de datos SPA predeterminado preinstalado en cada sistema Glacios. Los pasos del protocolo a continuación corresponden a la versión 2.14 de EPU y se esperan pequeñas modificaciones cuando se utiliza una versión de EPU diferente. Los requisitos previos para este protocolo son: i) las alineaciones de la pistola y la columna están bien alineadas, ii) las calibraciones EM son correctas y iii) las funciones automáticas de EPU están calibradas correctamente.

1. Rejillas de carga en el microscopio

NOTA: El TEM de 200 kV utilizado en este experimento puede contener hasta 12 autorredes (es decir, rejillas TEM convencionales enganchadas en un cartucho especial) dentro de un cassette que se carga dentro del cargador automático del microscopio y se mantiene constantemente a temperaturas inferiores a -170 ° C para evitar la desvitrificación de la muestra.

1. Inserte las autorredes en el cassette Autoloader en condiciones de nitrógeno líquido.
2. Inserte el cassette con autogrids en una cápsula de transferencia refrigerada por nitrógeno líquido.
3. Inserte la cápsula en el microscopio y haga clic en el botón Dock en la interfaz de usuario del microscopio para cargar el cassette de la cápsula en el cargador automático del microscopio.
4. Haga clic en el botón Inventario para comprobar la presencia de autorredes en el casete cargado.
5. Haga clic en los botones Cargar y Descargar para insertar cuadrículas automáticas en la columna para imágenes TEM.

2. Configuración de un proyecto en una plataforma de gestión de datos (opcional)

NOTA: La información de muestra y los datos recopilados se pueden organizar en la plataforma de gestión de datos proporcionada que permite el almacenamiento de datos estructurados para todos los instrumentos conectados. Se puede crear un proyecto para el que se pueden definir los pasos del flujo de trabajo para capturar las imágenes y los metadatos de forma organizada para su revisión y exportación.

1. Inicie la aplicación del portal de administración de datos e inicie sesión con un nombre de usuario y contraseña.
2. En el panel izquierdo de la interfaz de usuario del portal, haga clic en el botón Agregar proyecto para crear un nuevo proyecto o haga clic en un botón de un proyecto existente en la lista a continuación para abrir un proyecto.
3. Haga clic en el botón Agregar experimento para crear un nuevo experimento dentro del proyecto abierto.
4. Complete la descripción en el panel Metadatos del nuevo experimento y haga clic en el botón Agregar flujo de trabajo para crear un nuevo flujo de trabajo dentro del experimento (por ejemplo, Análisis de partículas únicas).
5. Opcionalmente, haga clic en el botón Agregar paso en el panel central para crear un flujo de trabajo personalizado o agregue pasos adicionales al flujo de trabajo SPA predefinido (Figura 1 y Figura 2).
   NOTA: Los pasos pueden representar la preparación de muestras, la caracterización de muestras mediante técnicas bioquímicas, la vitrificación de muestras, la detección de cuadrículas crio-EM, las sesiones de recolección de datos y el análisis de datos.
6. Opcionalmente, rellene las descripciones en las Notas de cada paso, que pueden incluir imágenes y fotos.
7. Cree un paso de conjunto de datos en el flujo de trabajo y seleccione el tipo de conjunto de datos como EPU.
   NOTA: Esto permitirá que el software de análisis coloque todos los datos / metadatos de resultados en el lugar correcto en el portal de administración de datos automáticamente durante la adquisición de datos y exporte los datos automáticamente al destino preferido mientras mantiene un registro completo de todos los pasos y la transferencia de datos.
8. Rellene plantillas sobre las cuadrículas de muestra y EM en el paso Bioquímica y asocie cada cuadrícula con una muestra (tenga en cuenta que una muestra se puede asociar con varias cuadrículas).
9. Asocie combinaciones de cuadrículas de muestra en la sección de metadatos del paso Conjunto de datos .

3. Configure ajustes preestablecidos de imágenes y calibraciones de cambio de imagen en el software de análisis

1. Establezca parámetros de imagen para modos de imagen individuales como se muestra en la Tabla 1. Las consideraciones para la selección de configuraciones específicas se describen en detalle en la sección Discusión.
2. Establecer iluminación paralela para la ampliación elegida en el ajuste preestablecido de adquisición de datos del software de análisis
   NOTA: Solo hay un ajuste de la lente C2 para la iluminación paralela de la muestra en el tamaño SPOT dado (es decir, las intensidades preestablecidas de la lente C1) en sistemas TEM de 2 condensadores, como el TEM de 200 kV utilizado en este estudio. Por lo tanto, la tasa de dosis de electrones por unidad de área (e^-/Ų/s) solo se puede ajustar cambiando la configuración del tamaño SPOT y reajustando la fuerza C2 (intensidad del haz) de acuerdo con los pasos a continuación.
   1. Muévase a un área con papel de carbono de soporte y hielo delgado o nulo.
   2. Seleccione la apertura del objetivo de 100 μm o 70 μm en el menú Apertura de la interfaz de usuario tem.
   3. Pulse el botón Difracción de los paneles de control para cambiar al modo de difracción.
   4. Inserte la pantalla fluorescente y cambie el modo FluCam a Alta resolución.
   5. Mueva el punto de difracción central a un borde de la abertura. Si el borde de apertura no es visible, aumente la longitud de la cámara (con la perilla de ampliación).
   6. Gire con cuidado la perilla de enfoque en el panel de control para enfocar el plano focal posterior. El plano retrofocal se enfoca cuando el borde de apertura es visiblemente nítido.
   7. Reduzca la sensibilidad de la FluCam al nivel más bajo y mueva el punto de difracción central al centro de la FluCam.
   8. Minimice el tamaño del punto central utilizando la perilla intensidad del panel de control.
   9. Retraiga la apertura del objetivo en la interfaz de usuario TEM y vuelva al modo de imagen.
   10. Haga clic en el botón Obtener en el software de análisis para guardar la configuración en el ajuste preestablecido de adquisición de datos.
3. Ajuste la tasa de dosis de electrones en el ajuste preestablecido de adquisición de datos que es óptimo para el detector utilizado:
   1. Muévase a un área vacía en la cuadrícula (por ejemplo, un cuadrado de cuadrícula con lámina de carbono rota)
   2. Haga clic en el botón Medir dosis en el software de análisis para medir la tasa de dosis de electrones.
   3. Cambie el tamaño de SPOT para lograr la tasa de dosis óptima. En el caso del detector directo de electrones utilizado en este protocolo, normalmente se utiliza una tasa de dosis de 4-5 e^-/pixel/s para la adquisición de datos de alta resolución. Esto generalmente corresponde al tamaño SPOT 4-6.
   4. Compruebe y ajuste la iluminación paralela en la nueva configuración de tamaño SPOT como se describe anteriormente.
   5. Seleccione la opción EER en Fracciones para utilizar el modo EER en el detector directo de electrones³³.
   6. Haga clic en el botón Obtener en el software de análisis para guardar la configuración en el ajuste preestablecido de adquisición de datos.
   7. Cambie al ajuste preestablecido de enfoque automático y presione el botón Obtener para guardar la configuración de iluminación para el enfoque. Cambie manualmente el tiempo de exposición a 1 s y el modo de binning 2.
   8. Cambie al ajuste preestablecido de Thon Rings y presione el botón Obtener para guardar la configuración de iluminación para este ajuste preestablecido. Cambie manualmente el tiempo de exposición a 1-2 s y el modo de binning 2.
   9. Cambie al ajuste preestablecido Zero Loss y presione el botón Obtener para guardar la configuración de iluminación para este ajuste preestablecido. Cambie manualmente el tiempo de exposición a 0,5 s y el modo de binning 4.
4. Calibrar los desplazamientos de imagen entre los ajustes ópticos establecidos como se describe en el manual del software de análisis mediante la tarea Calibración de desplazamiento de imagen en la ficha Preparación (Figura suplementaria 1).

Tabla 1: Ajustes de imagen típicos para la adquisición de datos de alta resolución utilizando un crio-TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo. Los ajustes se muestran para cada ajuste preestablecido óptico utilizado en la configuración de la recopilación automatizada de datos (sección 3 del Protocolo). Estos ajustes son específicos del microscopio TEM de 200 kV y el detector de electrones directo utilizado en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

4. Mapeo de cuadrícula y selección de las mejores cuadrículas crio-EM para la recopilación de datos

1. Seleccione la pestaña Atlas y haga clic en el botón Nueva sesión para abrir una nueva sesión.
2. Complete detalles como el nombre de la sesión y la ubicación de almacenamiento de datos y haga clic en el botón Aplicar para abrir una nueva ventana de tareas de selección , que muestra una lista de todas las cuadrículas en el inventario del cargador automático. Opcionalmente, edite los Nombres de las cuadrículas.
3. Seleccione las cuadrículas de interés seleccionando una casilla de verificación junto al número de cuadrícula correspondiente.
4. Haga clic en el botón Inicio para iniciar una colección totalmente automatizada de atlas de todas las cuadrículas seleccionadas.
5. Cuando se complete la colección, haga clic en las etiquetas de la cuadrícula para revisar los atlas adquiridos.
   NOTA: Los cuadrados de cuadrícula individuales se clasifican de acuerdo con su espesor de hielo relativo, que se basa en la evaluación del valor relativo de la escala de grises en cada atlas. Los cuadrados de cuadrícula clasificados se representan en diferentes esquemas de color que se pueden utilizar para guiar la selección de áreas de adquisición de datos. Una rejilla producida con un Vitrobot Mk IV normalmente mostrará un gradiente de espesor de hielo en toda la cuadrícula, lo que podría ayudar a identificar el espesor de hielo ideal para la recopilación de datos. Una rejilla óptima debe contener la menor contaminación posible por hielo de transferencia y exhibir suficientes cuadrados de rejilla intactos y libres de grietas (Figura 3). Las rejillas con una distribución de hielo adecuada se pueden investigar más a fondo para evaluar la distribución de partículas en el hielo a gran aumento (es decir, la densidad y las orientaciones de las partículas individuales).
6. Haga clic en el botón Cargar muestra en el menú superior para insertar una cuadrícula elegida con una distribución de hielo adecuada en la columna del microscopio.
7. Seleccione la pestaña Atlas , haga clic con el botón derecho en un cuadrado de cuadrícula adecuado en la imagen del atlas y seleccione la opción Mover etapa aquí en el menú desplegable para mover el escenario al cuadrado de cuadrícula.
8. Seleccione la ficha Funciones automáticas para establecer el cuadrado de la cuadrícula en la altura eucéntrica. Cambie al ajuste preestablecido eucéntrico de altura , haga clic en la función automática Auto-Eucentric by Beam Tilt en el centro del cuadrado de cuadrícula elegido y haga clic en el botón Inicio .
9. Cambie al ajuste preestablecido Grid Square y adquiera una imagen. Mueva el escenario a un agujero con hielo y sin o con una contaminación mínima con un clic con el botón derecho y la opción Mover etapa aquí .
10. Cambie al ajuste preestablecido Hole/Eucentric Height y adquiera una imagen. Mueva el escenario a un área de carbono junto al agujero de interés haciendo clic con el botón derecho y la opción Mover etapa aquí .
11. Haga clic en la función automática de enfoque automático y establezca los valores para el desenfoque deseado a 0 μm e Iterar a -2 μm. Cambie al ajuste preestablecido de enfoque automático y haga clic en el botón Inicio .
12. Vuelva a seleccionar la pestaña Preparación y cambie al ajuste preestablecido Hole/Eucentric Height . En la imagen del taladro adquirida anteriormente, seleccione un área de interés dentro del taladro y mueva el escenario a esta posición haciendo clic con el botón derecho y seleccionando la opción Mover escenario aquí .
13. Cambie al ajuste preestablecido de adquisición de datos y establezca el tiempo de espera después del cambio de haz a 0,5 s y el tiempo de espera después del movimiento de etapa a 20 s. Adquiera una imagen utilizando el desenfoque entre -3 μm y -5 μm para aumentar el contraste de baja resolución para una mejor visualización de partículas individuales.
14. Opcionalmente, repita los pasos 4.7-4.13 para obtener imágenes de partículas en diferentes orificios y diferentes cuadrados de cuadrícula con diferentes espesores de hielo según sea necesario.
15. Una vez que se identifique y seleccione la cuadrícula más adecuada para la recopilación de datos de alta resolución, haga clic en el botón Cargar muestra en el menú superior para cargar la cuadrícula seleccionada en el TEM.
    NOTA: Alternativamente, si se necesita más información y/o se desea la automatización de este proceso de selección, realice la sección 5.

5. Configuración de una sesión de recopilación de datos en el software de análisis de partículas individuales

NOTA: Si se utilizan las rejillas de lámina de oro, el refinamiento del astigmatismo objetivo y las alineaciones de coma (sección 6) puede no funcionar de manera confiable. Se recomienda cargar una rejilla de lámina de carbono o una rejilla EM de rejilla cruzada y realizar estas alineaciones finales antes de configurar la recopilación de datos.

1. Seleccione la pestaña EPU y haga clic en el botón Creación de sesión para crear una nueva sesión en el panel izquierdo. Seleccione la opción Nueva sesión para utilizar los ajustes preestablecidos ópticos actuales o la opción Nuevo desde preferencias para cargar la configuración de sesión exportada anteriormente.
2. Rellene el nombre de la sesión y la ubicación de almacenamiento de datos.
   NOTA: Esta ubicación se utilizará para guardar imágenes y metadatos integrados de la sesión de recopilación de datos en una subcarpeta con el nombre de la sesión. Aunque estos datos no ocuparán una cantidad significativa de espacio de almacenamiento, se recomienda guardar estos datos en el almacenamiento de datos de descarga Falcon del servidor DMP, ya que los marcos de la cámara EER siempre se almacenan en el directorio raíz de este almacenamiento de datos en un directorio con el nombre de la sesión.
3. Seleccione el tipo Manual de la sesión para tener control sobre la selección de taladros individuales en cuadrados de cuadrícula seleccionados para la recopilación de datos más adelante en el protocolo.
4. Seleccione el modo de adquisición más rápido para utilizar el desplazamiento de imagen sin aberraciones (AFIS) para la recopilación de datos a fin de reducir los movimientos de etapa entre agujeros individuales, reducir la deriva general de la muestra y aumentar el rendimiento de la recopilación de datos sin deterioro de la calidad de la imagen.
5. Seleccione el formato mrc predeterminado de las imágenes integradas guardadas.
6. Especifique la cuadrícula utilizada y su tipo. Este protocolo utilizó el R-1.2/1.3 UltraAufoil para la apo-ferritina y la rejilla R-2/1 Quantifoil para el proteasoma 20S. Seleccione Quantifoil en Portador de muestra y R1.2/1.3 o 2/1 en Quantifoil Type.
7. OPCIONAL: Haga clic en el botón Athena Login en la esquina inferior derecha para utilizar EPU Quality Monitor (EQM).
   1. Introduzca los detalles de inicio de sesión en la ventana emergente del navegador para activar la sección de configuración en la descripción general de la configuración de la sesión .
   2. Haga clic en el botón Seleccionar en la sección de configuración y busque el conjunto de datos creado anteriormente (sección 2 del protocolo) para asociarlo con la recopilación de datos actual. Active la casilla de verificación Habilitar monitor de calidad .
8. Haga clic en el botón Aplicar para crear una nueva sesión.
   NOTA: Esta acción abrirá nuevas tareas en el menú de la columna izquierda. En cualquier momento de la sesión, si algunos detalles son incorrectos, es posible volver a la tarea Configuración de sesión , cambiar / actualizar los detalles y hacer clic en Aplicar nuevamente para actualizar la sesión.
9. Seleccione la tarea Selección de cuadrados en el panel izquierdo para mostrar el atlas recopilado de la cuadrícula.
10. Opcionalmente, haga doble clic en cualquier mosaico del atlas para ver una imagen de mayor calidad para juzgar mejor la calidad del hielo en los cuadrados de la cuadrícula. Haga doble clic de nuevo en la imagen para volver al atlas de cuadrícula.
11. Identifique los cuadrados de la rejilla con las siguientes características (Figura 4): (i) La lámina de soporte en el cuadrado de la rejilla está intacta sin daños, (ii) Hielo delgado vítreo en los orificios de la lámina (los agujeros parecen más brillantes que la lámina de carbono de soporte), (iii) Tan poca contaminación de hielo cristalino (manchas negras) en el cuadrado de la rejilla como sea posible, (iv) Gradiente de brillo mínimo a través del cuadrado de la rejilla y dentro de los agujeros de lámina individuales.
    NOTA: Con los ajustes preestablecidos elegidos y con una buena cuadrícula, el TEM criogénico de 200 kV utilizado en este estudio puede obtener imágenes a una velocidad de ~ 200-300 películas / h. Con eso en mente, seleccione tantos cuadrados como sea necesario, o agregue más tarde volviendo a la tarea de selección de cuadrados de acuerdo con la cantidad de tiempo de microscopio disponible. Como referencia, se recopilaron 3000 películas para lograr una resolución de 1,6 Å de apo-ferritina.
12. Seleccione cuadrados de cuadrícula para la recopilación de datos, ya sea en el atlas completo o en imágenes de mosaico de alta calidad
    1. Haga clic con el botón derecho en un cuadrado de cuadrícula de interés y elija la opción Seleccionar en el menú contextual
    2. Alternativamente, mantenga presionada la tecla Ctrl en el teclado y haga clic izquierdo en los cuadrados de cuadrícula deseados
    3. Por el contrario, haga clic con el botón derecho y anule la selección o mantenga presionada la tecla Mayús y haga clic con el botón izquierdo para eliminar los cuadrados
    NOTA: Los siguientes pasos son críticos para garantizar que la recopilación de datos resulte en una reconstrucción de alta resolución. Comience la selección de agujeros en el cuadrado de la cuadrícula con una capa de hielo delgada. Haga clic con el botón derecho en este cuadrado de cuadrícula y seleccione la opción Seleccionar taladros para comenzar la tarea Selección de taladros .
13. Seleccione la tarea Selección de taladros en el panel izquierdo para seleccionar taladros en los cuadrados de cuadrícula seleccionados.
14. Haga clic en el botón Auto-Eucentric para moverse automáticamente al primer cuadrado de cuadrícula seleccionado, ajustar la altura eucéntrica y adquirir una imagen cuadrada de cuadrícula para encontrar agujeros de lámina.
15. Haga clic en el botón Buscar taladros para encontrar agujeros de lámina en la imagen.
    NOTA: Si la búsqueda de taladros no funcionó bien (es decir, hay taladros omitidos o agujeros de tamaño incorrecto en la imagen), compruebe que se introdujeron los valores correctos en la entrada Tipo de quantifoil de la tarea Configuración de sesión y vuelva a encontrar taladros. Si los orificios aún no se encuentran correctamente, haga clic en el botón Medir tamaño de orificio para establecer manualmente el diámetro y la distancia del orificio y volver a encontrar agujeros.
16. Haga clic en el botón Quitar taladros cerca del botón de la barra de cuadrícula para anular la selección de taladros cerca de las barras de cuadrícula.
17. Ajuste los límites en el histograma de brillo del filtro de hielo (en la parte inferior derecha de la ventana del software) para eliminar todos los orificios con hielo demasiado grueso (utilizando la línea de límite izquierda), así como todos los orificios vacíos (utilizando la línea de límite derecha) como se muestra en la Figura 4.
    NOTA: Para el refinamiento, también se pueden introducir valores de intensidad específicos en los cuadros de texto correspondientes junto al botón Aplicar .
18. Opcionalmente, utilice el Pincel de selección para refinar la selección de taladros manualmente: pulse con el botón izquierdo y arrastre el pincel para anular la selección de taladros no deseados. Mantenga presionada la tecla Ctrl y haga clic con el botón izquierdo para volver a seleccionar los orificios de la lámina. Mantenga pulsada la tecla Mayús y desplácese con la rueda del ratón para ajustar el tamaño del pincel.
19. Seleccione un taladro para configurar y probar una plantilla de adquisición de datos que se utilizará repetidamente a lo largo de la recopilación de datos: haga clic con el botón derecho en un taladro en la imagen cuadrada de la cuadrícula y seleccione la opción Mover escenario a la ubicación.
20. Seleccione la tarea Definición de plantilla en el panel izquierdo.
21. Seleccione el ajuste preestablecido Hole/Eucentric y haga clic en el botón Adquirir para adquirir una imagen.
22. Haga clic en el botón Buscar y centrar taladro para centrar un taladro en la imagen.
23. Establezca los valores de Delay After Image Shift a 0,5 s (predeterminado) y Delay After Stage Shift a 20 s.
    NOTA: Como el diámetro del haz paralelo se fija en el sistema crio-TEM de 200 kV utilizado en este estudio y generalmente corresponde a 1.6-1.7 μm con una apertura de 50 μm, solo se puede adquirir 1 imagen por agujero utilizando las rejillas R-1.2 / 1.3 y 2 imágenes por agujero (bordes casi opuestos) usando las rejillas R-2/1 o R-2/2. Tenga en cuenta que el tamaño de las áreas de adquisición establecidas en la pantalla no corresponde al diámetro real del haz. La barra de escala de imagen se puede utilizar para estimar una distancia de colocación adecuada.
24. Seleccione el botón Agregar área de adquisición y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en el orificio centrado desde donde se tomará la adquisición de imágenes de alto aumento.
25. Seleccione el botón Agregar área de enfoque automático y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en la lámina de soporte junto al orificio centrado donde se realizará el enfoque automático de la imagen.
    NOTA: El tamaño del haz para el enfoque es de 1.6-1.7 μm y debe colocarse equidistantemente de los agujeros vecinos en el carbono.
26. Haga clic en el área verde de adquisición para establecer una secuencia de valores de desenfoque en la Lista de desenfoque en la sección superior de la ventana del software. Introduzca el desenfoque más alto como primero para mejorar la visualización de las partículas en una ejecución de prueba de la siguiente tarea de ejecución de plantillas.
27. Haga clic en el área de enfoque automático azul para establecer la configuración específica del enfoque automático en la misma área:
    1. Elija la opción Después del centrado para enfocar automáticamente al inicio de cada clúster AFIS.
    2. Elija la opción Lente de objetivo para un enfoque automático más rápido y una deriva de etapa reducida.
28. Seleccione la tarea Ejecución de plantilla y haga clic en el botón Ejecutar.
    1. Observe los pasos individuales del procedimiento de adquisición de datos (centrar el agujero, el enfoque automático en el área seleccionada y la adquisición de imágenes en las áreas establecidas) y verifique la calidad de las partículas fotografiadas en la imagen final de alto aumento.
    2. Haga clic en el botón FFT en la parte inferior derecha de la ventana de la imagen de alta ampliación para verificar la imagen FFT y evaluar visualmente si los anillos Thon muestran múltiples oscilaciones y se extienden a alta resolución en la imagen FFT.
29. Si la ejecución de la plantilla se completa correctamente, haga clic en el botón Preparar todos los cuadrados en la tarea Selección de taladros para que la recopilación de datos se establezca automáticamente en todos los demás cuadrados de cuadrícula seleccionados de acuerdo con la configuración utilizada en este primer cuadrado de cuadrícula.

6. Alineaciones finales del microscopio antes de comenzar la recopilación de datos

NOTA: Para lograr los mejores resultados de alta resolución, las alineaciones más sensibles deben realizarse exactamente en la misma configuración que el modo de adquisición de datos en el software de recopilación de datos y justo antes de iniciar la adquisición de datos real. Estas alineaciones deben hacerse en una posición con carbono de soporte delgado de la rejilla, lo suficientemente distante de cualquier barra de la rejilla y alineada a la altura eucéntrica.

1. Seleccione la tarea Ejecución de plantilla, adquiera una nueva imagen y muévase con el escenario a un área limpia en papel de carbón haciendo clic con el botón derecho y seleccione la opción de menú Mover etapa aquí.
2. Seleccione la ficha Funciones automáticas y establezca el desenfoque deseado en 0 μm e Iterar en -2 μm. Cambie al ajuste preestablecido de enfoque automático y haga clic en el botón Inicio para ejecutar la función de enfoque automático.
3. Coloque la pantalla fluorescente y abra el menú de Alineaciones directas en la interfaz de usuario de TEM.
4. Para obtener los mejores resultados, los usuarios experimentados pueden verificar las alineaciones de los puntos de pivote: Elija la tarea nP Beam Tilt pp X en el menú Alineaciones directas y superponga al máximo las vigas de rebote utilizando las perillas multifunción en los paneles de control. Repita para la tarea np Beam Tilt pp Y .
5. Haga clic en el botón EF en el menú de la cámara de la pantalla fluorescente para mostrar un círculo verde que indica la apertura de entrada del filtro de energía y centra el haz sobre el círculo verde.
   NOTA: Asegúrese de que la bomba Turbo esté detenida antes de continuar; las vibraciones de él reducen el número de anillos visibles y con frecuencia hacen que las funciones automáticas fallen.
6. Vuelva a la ventana del software y seleccione la pestaña Funciones automáticas en la barra de menús.
7. Seleccione la tarea Autostigmate , cambie al ajuste preestablecido Thon Ring y presione el botón Inicio . Observe el proceso para asegurarse de que (i) las imágenes tomadas están en carbono, (ii) los anillos de Thon son claramente visibles y (iii) el ajuste CTF calculado (líneas punteadas) está bien colocado en el mínimo de anillo de Thon (Figura suplementaria 2).
8. Seleccione la tarea Autocoma y pulse el botón Inicio . Observe el proceso para asegurarse de que las imágenes tomadas son de carbono y que los anillos de Thon son claramente visibles y que los ajustes calculados (líneas punteadas) están bien colocados en los mínimos de anillo de Thon. Amplíe cada imagen de Thon-ring usando la rueda de desplazamiento del mouse (Figura suplementaria 3).
   NOTA: Si el microscopio está equipado con un filtro de energía, el ajuste del filtro de energía debe realizarse como parte de la secuencia de alineación para centrar la ranura del filtro al pico de pérdida cero y para corregir cualquier distorsión en el prisma del filtro de energía (pasos 6.9-6.14). Estas alineaciones deben hacerse en un área vacía de la rejilla, como dentro de un cuadrado de cuadrícula roto.
9. Abra Sherpa UI y seleccione la aplicación Filtro de energía (Figura suplementaria 4).
10. Ajuste la cámara a EF-Falcon, bin 4x, tiempo de exposición 0.2 s en la ventana Configuración .
11. Haga clic en el botón Centrar en la opción Cero pérdida para centrar la ranura del filtro de energía de pérdida cero.
12. Haga clic en el botón Sintonizar en la opción Isocromaticidad (Figura suplementaria 4).
13. Haga clic en la Ampliación de sintonización y Distorsiones de sintonía en la opción de Distorsiones geométricas y cromáticas (Figura suplementaria 5, Figura suplementaria 6)
14. Si los resultados no están dentro de las especificaciones indicadas y se muestran en color rojo en el informe de salida, repita de nuevo las alineaciones del paso 6.11.
    NOTA: Aunque la referencia de ganancia directa del detector de electrones puede ser estable durante meses, se debe tomar una nueva referencia de ganancia utilizando el Administrador de imágenes de referencia de Falcon 4 si las imágenes de áreas vacías no muestran una intensidad uniforme pero exhiben rayas u otras características distintas. Alternativamente, calcule una transformada rápida de Fourier (FFT) de dicha imagen y asegúrese de que no haya líneas visibles.
15. En la ventana de software, seleccione la pestaña Preparación y cambie al ajuste preestablecido de adquisición de datos .
16. Establezca la configuración de dosis en 40 e^-/Ų y haga clic en el botón Medir la tasa de dosis .
17. Vaya a la pestaña EPU , seleccione la tarea Adquisición automatizada y, opcionalmente, verifique la función Auto Zero Loss ; haga clic en el botón Iniciar ejecución para comenzar la recopilación de datos totalmente automatizada.

7. Monitoreo y optimización de la calidad de los datos durante la recopilación de datos

NOTA: Mientras la recopilación de datos está en curso, los datos recopilados se pueden monitorear utilizando el EQM a través del portal de administración de datos. EQM realiza la corrección de movimiento y la determinación de CTF sobre la marcha y muestra los resultados en el portal. El usuario puede juzgar la calidad de las adquisiciones individuales, ver gráficos sobre varios indicadores de calidad, filtrar las adquisiciones no deseadas y exportar los datos a su almacenamiento final, ya sea sobre la marcha o como un trabajo por lotes.

1. Navegue hasta el conjunto de datos en el que el software de análisis coloca los datos utilizando un navegador web.
2. En la descripción general del conjunto de datos, las tarjetas de adquisición muestran la información sobre la corrección de movimiento y la determinación de CTF en un formato gráfico. Haga clic en tarjetas individuales para obtener más información.
3. Habilite el panel DataViz para mostrar gráficos agregados del conjunto de datos completo que muestran el desenfoque, el astigmatismo y el rango de confianza CTF por adquisición (Figura suplementaria 7).
4. Utilice los filtros en la parte superior del panel para seleccionar solo los datos que están dentro del rango de desenfoque solicitado, tienen astigmatismo cercano a cero y el CTF se puede determinar hasta la resolución especificada (objetivo). Una vez configurados los filtros, pulse el botón Aplicar para mostrar solo los datos elegidos en la ventana de información general del conjunto de datos.
5. Cuando la mayoría de las imágenes adquiridas estén dentro de los criterios establecidos, deje que la sesión de recopilación de datos continúe hasta su finalización. Si solo una fracción muy pequeña de las imágenes adquiridas cumplen con los criterios establecidos, vuelva a configurar la configuración del software de análisis, muévase a otra área de la muestra (presione el botón Siguiente cuadrado de cuadrícula en el software de análisis) o detenga la recopilación de datos.

Resultados

El portal de administración de datos proporciona un almacenamiento eficiente y estructurado de imágenes, datos y metadatos recopilados de múltiples flujos de trabajo experimentales en una sola plataforma de software. Cada experimento definido en un proyecto creado consiste en un flujo de trabajo con pasos definidos por el cliente para capturar información de muestra, datos recopilados y metadatos relacionados sin ninguna restricción para proporcionar la máxima flexibilidad y usabilidad para cualquier experimento posible y todos los casos de uso (Figura 1, Figura 2). El portal de gestión de datos también tiene una funcionalidad de nota de laboratorio para ilustrar los pasos del flujo de trabajo, incluido el procesamiento de imágenes con resultados intermedios, que se pueden asociar todos juntos con un proyecto y proporcionar un registro lo más completo posible para el análisis y la creación de informes y publicaciones.

Figura 1: Ejemplo de posible organización de datos y metadatos en la plataforma de gestión de datos. Cada proyecto puede consistir en múltiples experimentos, como crio-EM o espectroscopia de masas (a saber, el paso de protocolo 2.3). Cada experimento puede incluir varios flujos de trabajo definidos por el usuario (a saber, el paso 2.5 del protocolo), cada uno de los cuales consta de varios pasos configurables (a saber, el paso 2.7 del protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ver en un flujo de trabajo de proyecto abierto en la plataforma de gestión de datos. La figura muestra los metadatos y notas asociados al paso abierto en el flujo de trabajo. La barra izquierda con iconos proporciona un acceso rápido a diferentes opciones y menús de la plataforma de gestión de datos. El panel izquierdo incluye una lista de flujos de trabajo guardados (se muestra solo un flujo de trabajo guardado "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") y un botón azul para agregar un nuevo flujo de trabajo. El panel central muestra los pasos individuales en el flujo de trabajo abierto, como se muestra para el flujo de trabajo de SPA aquí. El botón azul en la parte superior derecha puede agregar un paso adicional al flujo de trabajo abierto. El panel derecho incluye espacio para metadatos grabados o notas de entrada de usuario del flujo de trabajo, que pueden incluir texto, tablas e imágenes. Hay diferentes opciones de formato disponibles para el texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las rejillas Cryo-EM producidas con dispositivos tradicionales de congelación por inmersión, como Vitrobot, generalmente mostrarán un gradiente de espesor de hielo sobre la superficie de la rejilla. Algunas rejillas también pueden dañarse (doblarse) después de la manipulación manual y / o el recorte en un portador de anillo de rejilla automática. La Figura 3 muestra ejemplos de diferentes cuadrículas como se muestra en la descripción general del Atlas. Las rejillas con hielo grueso o daños deben excluirse de una investigación adicional.

Figura 3: Galería de diferentes cuadrículas como se ve en la descripción general del Atlas. (A) Una rejilla mala con hielo grueso, (B) una rejilla doblada con hielo malo y contaminación por hielo, (C) una rejilla aceptable con buen gradiente de hielo, (D) una rejilla típica con buen hielo delgado y un gradiente de hielo pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La selección de cuadrados de cuadrícula sin daños y con un espesor de hielo óptimo es fundamental para recopilar conjuntos de datos de alta resolución. El espesor del hielo puede variar incluso a nivel de cuadrados de cuadrícula individuales, y por lo tanto, es importante seleccionar solo agujeros con hielo óptimamente delgado de cada cuadrado de cuadrícula seleccionado. La Figura 4 muestra un cuadrado de cuadrícula adecuado con lámina intacta y hielo delgado en el centro. El cuadrado de cuadrícula mostrado es bueno para configurar un filtro para la selección automatizada de agujeros con hielo delgado en todos los cuadrados de cuadrícula seleccionados, ya que contiene un rango de diferentes espesores de hielo, así como agujeros vacíos sin hielo, lo cual es extremadamente útil para establecer un rango apropiado de intensidad en el filtro de hielo en la tarea de selección de agujeros.

Figura 4: Un cuadrado de cuadrícula de ejemplo con un gradiente de espesor de hielo, a partir de cuadrados de cuadrícula vacíos en el centro y hielo grueso cerca de las barras de rejilla. El filtro de calidad de hielo se puede utilizar para seleccionar el rango de intensidades dentro de los orificios con el espesor de hielo ideal que se seleccionan en consecuencia en el cuadrado de la cuadrícula (los agujeros con superposición verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados de referencia utilizando el protocolo descrito se obtuvieron utilizando la muestra de apo-ferritina de ratón (apoF) del grupo de Kikkawa¹¹. ApoF es una proteína helicoidal altamente α que forma una jaula octaédrica muy estable. La alta estabilidad y la alta simetría hacen de apoF una muestra óptima para imágenes crio-EM de alta resolución y procesamiento de imágenes. Por lo tanto, ApoF se ha convertido en una muestra estándar para evaluar el rendimiento de los instrumentos crio-EM ^11,12,13. Una alícuota congelada que contenía una muestra de apoF purificada de 15 mg/ml se descongeló en hielo y se clarificó por centrifugación a 10.000 x g durante 10 min. El sobrenadante se diluyó a 5 mg/ml con 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl. Se aplicaron 3 μL de la muestra diluida sobre una rejilla de oro de malla R-1.2/1.3 con descarga de resplandor durante 30 s. Luego, las rejillas se borraron durante 5 s antes de sumergirse en etano líquido enfriado por nitrógeno líquido. La congelación por inmersión se realizó utilizando un sistema de vitrificación totalmente automatizado al 100% de humedad y 4 °C. Todas las rejillas se recortaron en autorredes y se cargaron en un Cryo-TEM de 200 kV. Se recolectaron alrededor de 3000 películas a un rendimiento de 300 películas / h. Los datos se procesaron utilizando los métodos descritos¹¹ con las siguientes modificaciones: i) se utilizó la versión 4-beta de Relion en lugar de Relion 3.1, ii) la selección automatizada de partículas se realizó utilizando promedios de clase 2D de reconstrucciones apoF anteriores como referencias, y iii) el modelo 3D inicial se generó a partir de la reconstrucción apoF anterior de baja resolución pasada a 15-Å. No se realizó la agrupación óptica para este conjunto de datos, ya que se ha demostrado que el procedimiento AFIS³⁴ utilizado minimiza de manera eficiente y confiable los cambios de fase inducidos por la inclinación del haz que no limitan la calidad de los datos para reconstruir mapas 3D a las resoluciones informadas. El refinamiento 3D después del pulido bayesiano y el refinamiento CTF llevaron a un mapa de resolución de 1.68 Å. La resolución se mejoró aún más con la corrección de la esfera de Ewald, lo que resultó en un mapa de resolución de 1,63 Å. La descripción general de los parámetros de recopilación y procesamiento de datos se muestra en la Tabla 2, y el mapa de densidad reconstruido final se muestra en la Figura 5, con la curva de Correlación de Concha de Fourier (FSC) que se muestra en la Figura Suplementaria 8.

Tabla 2: Recopilación de datos y parámetros de procesamiento de imágenes utilizados para la reconstrucción 3D de la apo-ferritina. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 5: Reconstrucción crio-EM de apo-ferritina. (Panel izquierdo) Representación 3D del mapa crio-EM de apoF reconstruido a una resolución de 1,6 Å. (Panel derecho) Vista detallada del mapa reconstruido a nivel de cadenas laterales de aminoácidos individuales. La densidad de las cadenas laterales de aminoácidos está bien resuelta, y el modelo atómico se puede construir inequívocamente dentro de este mapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los efectos y beneficios del uso de un filtro de energía en las reconstrucciones de SPA se evaluaron utilizando el proteasoma procariota 20S aislado de T. acidophilum. El proteasoma procariota 20S también se ha utilizado como una muestra crio-EM estándar, ya que representa el núcleo catalítico estable del complejo proteasoma con la simetría D7. Las rejillas se prepararon agregando 4.5 μL de la muestra purificada de proteasoma T. acidophilum 20S en una rejilla de cobre R 2/1 de 200 mallas descargadas con brillo. Las muestras se vitrificaron en una mezcla líquida de etano/propano utilizando un sistema de vitrificación totalmente automatizado establecido a 4 °C y 100% de humedad con fuerza de borrado de 20 y tiempo de borrado de 4,5 s.

Se recopilaron tres conjuntos de datos diferentes de la misma cuadrícula crio-EM con cuadrados de cuadrícula similares utilizando un ancho de hendidura diferente del filtro de energía en el orden: i) hendidura completamente abierta (sin ranura insertada), ii) hendidura de 20 eV y iii) hendidura de 10 eV. Los cuadrados de la cuadrícula se seleccionaron utilizando un filtro de calidad de hielo dentro del software de análisis. Todos los demás parámetros para la recopilación y el procesamiento de datos se mantuvieron iguales. Los conjuntos de datos se recopilaron durante 15 h con un total de 4000 películas y se procesaron utilizando los métodos descritos¹¹ utilizando Relion 3.1 con la modificación de que el algoritmo de selección de partículas laplaciano de Gaussian se utilizó para producir promedios iniciales de clase 2D para la selección de partículas basada en referencia a partir de los conjuntos de datos completos. Se eligió el mismo número (102.200) de partículas seleccionadas al azar y se utilizó para la iteración final y la reconstrucción 3D de cada conjunto de datos. Las variables de procesamiento de datos se describen en la tabla (Tabla 3) a continuación para lograr el mapa de densidad EM reconstruido final que se muestra en la Figura 6 con la curva FSC que se muestra en la Figura Suplementaria 9. La agrupación óptica y la corrección de la esfera de Ewald tampoco se realizaron para estos conjuntos de datos.

Tabla 3: Parámetros de recolección de datos y procesamiento de imágenes utilizados para la reconstrucción 3D del proteasoma T. acidophilum 20S. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Resumen de la resolución alcanzada y el factor B para las reconstrucciones crio-EM del proteasoma T. acidophilum 20S utilizando conjuntos de datos con diferente ancho de hendidura de energía. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 6: Efecto del filtrado de energía en imágenes crio-EM. (A) Imágenes crio-EM a diferentes valores de desenfoque recopilados con o sin ranura de 10 eV. (B) Visión general del mapa crio-EM del proteasoma 20S con subunidades segmentadas. (C) Vista de zoom en el mapa del proteasoma 20S con un modelo atómico ajustado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Calibración de la tarea de desplazamientos de imagen (elipse amarilla) para alinear los cambios de imagen entre diferentes ajustes preestablecidos ópticos (elipses rojas) en el software de análisis, utilizando un cristal de hielo hexagonal que es visible en el rango de aumento completo entre 100x y 165,000x. (Arriba) Calibración entre los ajustes preestablecidos de Adquisición de datos y Altura de agujero/eucéntrico, calibración (media) entre los ajustes preestablecidos de Altura de orificio/eucéntrico y Cuadrado de cuadrícula, calibración (inferior) entre los ajustes preestablecidos de cuadrado de cuadrícula y Atlas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Función autostigma en software de análisis (elipse amarilla). (Imagen de la izquierda) Imagen adquirida. (Imagen derecha) Transferencia de Fourier de la imagen adquirida que muestra anillos de Thon concéntricos y su ajuste CTF mostrado en haces radiales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Interfaz de usuario de la función Autocoma en el software de análisis (elipse amarilla) para la alineación del coma. El panel de imágenes muestra imágenes de transferencia de Fourier adquiridas en diferentes inclinaciones de haz y sus ajustes CTF que se utilizan para el cálculo de la coma. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Interfaz de usuario de ajuste del filtro de energía. Ejemplo de un buen informe de sintonización de la isocromía del filtro de energía con todos los parámetros (mostrados en texto verde) dentro de las especificaciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Interfaz de usuario de ajuste del filtro de energía. Ejemplo de buen informe de ajuste de las distorsiones de aumento del filtro de energía con todos los parámetros (mostrados en texto verde) dentro de las especificaciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Interfaz de usuario de ajuste del filtro de energía. Ejemplo de buen ajuste de las distorsiones cromáticas del filtro de energía con todos los parámetros (mostrados en texto verde) dentro de las especificaciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Panel DataViz del Monitor de Calidad de la EPU con una visión general de la calidad de los datos en un conjunto de datos crio-EM recopilado. Los gráficos con datos agregados de todas las imágenes / películas recopiladas muestran valores (diagramas de puntos) y distribución (gráficos de barras) de indicadores de calidad críticos seleccionados, como la confianza de ajuste CTF (azul), el desenfoque (naranja) y el astigmatismo (verde). Se puede seleccionar un subconjunto de las imágenes/películas recopiladas estableciendo filtros de parámetros en la parte superior del panel DataViz. Después de aplicar los filtros, las imágenes / películas seleccionadas se pueden exportar para su posterior procesamiento en otro paquete de procesamiento de imágenes, como Relion o CryoSpark. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 8: Curva FSC de la reconstrucción final de apoF a resolución 1.6 Å, según lo informado por Relion 4-beta. La curva azul muestra el FSC de mapas 3D enmascarados de dos reconstrucciones 3D refinadas de forma independiente a partir de dos conjuntos de datos medios mutuamente excluyentes. De acuerdo con el estándar de oro FSC en 0.143, la resolución del mapa 3D final reconstruido a partir del conjunto de datos completo corresponde a 1.6 Å. La curva naranja muestra el FSC de las reconstrucciones 3D enmascaradas con fases aleatorias. La rápida caída de la curva FSC indica que la máscara utilizada no contribuyó al FSC observado de los mapas reconstruidos originales (curva azul) más allá de la resolución de ~ 2 Å. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 9: Curvas FSC de la reconstrucción final del proteasoma de T. acidophilum 20S utilizando diferentes anchos de hendidura del filtro de energía, según lo informado por Relion 3.1. Las curvas azules muestran el FSC de mapas 3D enmascarados a partir de dos reconstrucciones refinadas independientemente a partir de dos conjuntos de datos medios de cada conjunto de datos, respectivamente. El FSC estándar de oro en 0.143 indica las resoluciones alcanzadas de los mapas 3D finales reconstruidos a partir de los respectivos conjuntos de datos completos (resolución 2.3 Å, 2.2 Å y 2.1 Å, respectivamente). Las curvas rojas muestran el FSC de los mapas enmascarados con fases aleatorias. La rápida caída de las curvas FSC rojas indica que la máscara utilizada no contribuyó al FSC de los mapas reconstruidos originales más allá de la resolución de ~ 3 Å. Las curvas verdes muestran el FSC de los mapas 3D desenmascarados, que están influenciados por el ruido en todo el volumen 3D reconstruido y, por lo tanto, caen antes que el FSC de los mapas 3D enmascarados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Disponibilidad de los datos: Los mapas de densidad crio-EM se han depositado en el Banco de Datos em bajo los números de acceso: apoferritina: EMD 14173, EMPIAR-10973. Proteasoma 20S: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discusión

El protocolo descrito asume que la óptica del microscopio TEM utilizado está en un estado bien alineado. Para el TEM de 200 kV utilizado en este Protocolo, dichas alineaciones de columna son realizadas, verificadas y guardadas por un ingeniero de servicio experimentado después de la instalación del microscopio o cualquier intervención de servicio significativa. Estos ajustes de alineación se pueden recuperar en cualquier momento en la interfaz de usuario del microscopio. Los usuarios pueden usar los procedimientos de alineación directa en la interfaz de usuario del microscopio para reajustar los parámetros críticos. Algunas alineaciones, como la inclinación de la pistola y el cambio de la pistola, son estables y no necesitan ser ajustadas por los usuarios a diario. Se recomienda que el supervisor del microscopio realice comprobaciones y realineaciones (si es necesario) de la inclinación y el desplazamiento de la pistola dos veces al año. Por otro lado, algunas alineaciones son críticas y deben alinearse antes de cada recopilación de datos como se describe en el protocolo anterior (como el astigmatismo objetivo y la alineación libre de coma). Si la función Autocoma en el software de análisis no converge, se debe verificar y ajustar la alineación de los puntos de pivote de inclinación del haz y / o el centro de rotación, y se debe confirmar el centrado correcto de la apertura C2. Después, la función Autostigmate debe ejecutarse ya que también se utilizan estigmatizadores objetivos para la corrección del coma. Estas alineaciones deben iterarse hasta que tanto las funciones Autostigmate como Autocomafunctions tengan éxito en su primera iteración. Si es necesario, se puede seleccionar otra área (por ejemplo, apoyar la lámina de carbono sin hielo), ajustar el desenfoque de la imagen o aumentar el tiempo de adquisición de la imagen para optimizar la relación señal-ruido en las imágenes adquiridas y la visibilidad de múltiples anillos thon en la transformada de Fourier de las imágenes adquiridas.

Los microscopios crio-EM modernos generan grandes cantidades de datos que a menudo superan 1 TB por conjunto de datos para lograr reconstrucciones 3D de alta resolución, particularmente para proteínas con baja simetría. Los datos y resultados de cryo-EM también suelen complementarse con datos y resultados de métodos ortogonales para comprender completamente las relaciones estructura-función en cada proyecto científico. La organización de los datos recopilados, su transferencia a una tubería de procesamiento de imágenes y el intercambio de una reconstrucción crio-EM resultante entre los colaboradores imponen requisitos adicionales a los nuevos adoptantes de la metodología cryo-EM para configurar su infraestructura de TI local. El software de gestión de datos, como Athena, facilita el almacenamiento centralizado de los datos adquiridos por cualquier instrumento o software conectado operado por un usuario registrado. Los datos y metadatos almacenados son accesibles mediante una interfaz de navegador web simple por varios usuarios, que pueden tener diferentes roles en el proyecto con diferentes derechos de acceso (ya sea como propietario, colaborador o espectador) según sus credenciales de inicio de sesión y la definición de uso compartido de datos en la configuración del experimento. Esta digitalización de los flujos de trabajo experimentales proporciona medios para compartir datos y metadatos entre los colaboradores sin duplicaciones innecesarias y aumenta la productividad y la trazabilidad de los flujos de trabajo utilizados. La implementación de una estructura general y personalizable de proyectos, experimentos y flujos de trabajo en el software de gestión de datos es universal y permite la personalización e integración de experimentos ortogonales utilizando métodos complementarios en una sola base de datos de proyectos.

La selección de áreas para la recopilación de datos en una red crio-EM es fundamental para la adquisición exitosa de conjuntos de datos de alta resolución. Las rejillas Cryo-EM producidas con dispositivos tradicionales de congelación por inmersión, como el Vitrobot (un sistema de vitrificación totalmente automatizado), generalmente mostrarán un gradiente de espesor de hielo sobre la superficie de la rejilla (Figura 4). Esto puede ser beneficioso ya que la rejilla contiene áreas con diferentes espesores de hielo; sin embargo, las áreas con el espesor de hielo ideal para la recopilación de datos deben identificarse como se describe en el protocolo anterior. Una rejilla crio-EM óptima debe contener la menor contaminación posible por hielo de transferencia y contener suficientes cuadrados de rejilla con una lámina de soporte agujereada intacta. No se recomienda la recopilación de datos sobre cuadrados de cuadrícula que tienen grietas o áreas rotas, ya que las imágenes recopiladas se verán afectadas por una deriva general significativamente más fuerte al iluminar un haz de electrones en comparación con los cuadrados de la rejilla con lámina de soporte intacta. El exceso de hielo cristalino puede ocluir la mayoría de los agujeros de lámina y / o interferir con el enfoque automático y tales cuadrados de cuadrícula también deben evitarse. Los cuadrados de cuadrícula con hielo delgado generalmente exhiben grandes áreas vítreas y muchos agujeros de lámina brillantes que son visibles en una imagen tomada con el ajuste preestablecido Atlas. La aparición de hielo más grueso cerca de las barras de la rejilla es de esperar y no es crítica, ya que los agujeros de lámina en estas áreas del cuadrado de la rejilla se excluyen durante el procedimiento de selección de agujeros. La presencia de varios agujeros vacíos en un cuadrado de cuadrícula puede significar que el hielo vítreo en los agujeros circundantes es extremadamente delgado y puede contener partículas dañadas o ninguna partícula en absoluto. En general, es aconsejable elegir cuadrados de cuadrícula con una variedad de espesores de hielo en diferentes regiones de la cuadrícula para la detección y evaluación iniciales para comprender qué áreas tienen las mejores condiciones para la recopilación de datos de alta resolución y exhiben la densidad de partículas ideal y la distribución de orientación. Para las muestras de proteasoma apoF y 20S utilizadas en este estudio, las áreas con el hielo observable más delgado contienen las mejores condiciones para obtener imágenes de alta resolución de estas muestras.

Al seleccionar taladros automáticamente en todos los cuadrados de cuadrícula seleccionados utilizando el software de recopilación de datos, se recomienda realizar la tarea de ejecución de plantillas en un orificio representativo en cada cuadrado de cuadrícula para verificar y asegurarse de que no se eligieron cuadrados demasiado gruesos ni demasiado delgados ni inesperadamente no vítreos para la recopilación de datos. Durante la adquisición de datos, los indicadores clave de calidad de las imágenes recopiladas, como la deriva de la imagen y el ajuste CTF, se pueden monitorear utilizando EQM. La recopilación de datos se puede optimizar omitiendo áreas que producen imágenes de mala calidad. Sin embargo, las imágenes con ajustes CTF de alta resolución aún pueden contener imágenes con partículas en algunas orientaciones preferidas o partículas desnaturalizadas en una capa de hielo demasiado delgada. La selección de partículas en tiempo real y la clasificación 2D a partir de imágenes recopiladas proporcionarían información adicional sobre la calidad de los datos estructurales en las partículas fotografiadas y revelarían tanto las orientaciones preferidas de las partículas intactas en el hielo como la estructura inconsistente de las partículas (parcialmente) desnaturalizadas. Por lo tanto, el cálculo de los promedios de clase puede ayudar a refinar aún más las regiones apropiadas para la recopilación de datos, como ya se ha implementado y demostrado en otros paquetes^{de software 23,28}.

La selección de los ajustes de imagen para la adquisición de datos, como la ampliación, la tasa de dosis de electrones y el rango de desenfoque, depende de varios criterios, como la resolución objetivo, el tamaño de la proteína, la concentración de la muestra, el rendimiento deseado del microscopio, etc. Para la cámara detectora directa de electrones utilizada en estos experimentos, se eligió la tasa de dosis de electrones en el rango de 4-5 e^-/pix/s seleccionando un tamaño e intensidad SPOT apropiados para mantener la iluminación paralela. Como se muestra en la Tabla 1, se puede utilizar un tamaño SPOT diferente en el ajuste preestablecido Hole/Eucentric Height para asegurar una relación señal-ruido suficiente en la imagen para centrar los orificios durante la recopilación de datos. El aumento debe elegirse de tal manera que el tamaño del píxel sea al menos 2-3 veces más pequeño que la resolución objetivo para la reconstrucción crio-EM. Sin embargo, se utiliza el aumento más alto (es decir, un tamaño de píxel más pequeño), el campo de visión más pequeño se captura en las imágenes y hay menos partículas por imagen, lo que en última instancia conduce a un mayor tiempo de recopilación de datos para recopilar imágenes con suficientes partículas para reconstruir mapas 3D a una alta resolución. Para la muestra de apoF, utilizamos el tamaño de píxel de 0,43 Å, ya que teníamos suficiente concentración de muestra para una alta densidad de partículas en las imágenes y apuntamos a una resolución sub-2 Å de la reconstrucción. Para la muestra de proteasoma 20S, utilizamos el tamaño de píxel de 0,68 Å para cubrir un campo de visión más grande en las imágenes adquiridas. Por lo general, para los microscopios TEM de 200 kV, las imágenes crio-EM se adquieren en el rango de desenfoque de 0,8 a 2,0 μm. Sin embargo, con el contraste mejorado y la relación señal-ruido utilizando el filtro de energía, las adquisiciones de datos se pueden hacer mucho más cerca del enfoque para preservar mejor la información de alta resolución en las imágenes adquiridas debido a aberraciones más pequeñas y, en consecuencia, a la reducción de la descomposición de la función de envolvente CTF. Tampoco utilizamos una apertura objetiva, ya que la apertura puede introducir aberraciones adicionales de la imagen, mientras que el contraste de la imagen ya está lo suficientemente mejorado mediante el uso del filtro de energía. Para las muestras de proteasoma apoF y 20S, se utilizaron los ajustes de desenfoque de 0,5 μm, 0,7 μm y 0,9 μm. Para proteínas más pequeñas (<200 kDa), utilizamos ajustes de desenfoque de -0,5 μm, -0,7 μm y -0,9 μm para mejorar el contraste de las partículas y facilitar la selección de partículas y la alineación gruesa inicial en el paso de refinamiento 3D de la reconstrucción 3D, lo que condujo a mapas 3D de resolución de ~ 2,5 Å (resultados no publicados).

Ya hemos demostrado que las imágenes con un filtro de energía mejoran la relación señal-ruido (SNR) en imágenes crio-EM recogidas en los microscopios TEM de 300 kV de gama alta¹¹. De hecho, cuando los electrones pasan a través de una muestra, se producen dos tipos principales de interacciones: i) Los electrones dispersos elásticamente mantienen su energía y contribuyen a la formación de imágenes mediante la interferencia con el haz incidente no disperso a través del mecanismo de contraste de fase ii) los electrones dispersos inelásticamente pierden algo de energía en la muestra y contribuyen principalmente al ruido en las imágenes. Por lo tanto, SNR se puede mejorar significativamente filtrando los electrones dispersos inelásticamente, que tienen menor energía que el haz incidente y los electrones dispersados elásticamente, utilizando una estrecha hendidura de energía. Sin embargo, es fundamental utilizar un filtro de energía suficientemente estable, como el Selectris o el Selectris-X, para poder utilizar ranuras muy estrechas (10 eV o menos) durante la adquisición automatizada de datos de alta resolución (más de 12 horas) de conjuntos de datos crioEM de alta resolución.

Las imágenes crio-EM adquiridas con microscopios TEM de 200 kV en las mismas condiciones que con microscopios TEM de 300 kV exhiben un SNR más pequeño a alta resolución (particularmente <4 Å) debido a la desintegración más rápida de las funciones de la envoltura CTF. En consecuencia, se requiere un mayor número de partículas (y, por lo tanto, un mayor número de imágenes recopiladas) para lograr una cierta resolución cuando se utilizan TEM de 200 kV. Además, la profundidad de campo (10-25 nm en el rango de resolución 2-3 Å) también es aproximadamente un 20% más pequeña en imágenes de 200 kV³⁵, lo que significa que menos partículas en la capa de hielo (típicamente 20-50 nm de espesor) estarán completamente enfocadas y contribuirán constructivamente a todas las características de alta resolución de una reconstrucción 3D calculada a menos que los valores de desenfoque se refinen para cada partícula de forma independiente en las etapas posteriores del procedimiento de reconstrucción 3D. Para partículas más grandes (como viriones icosaédricos u otros conjuntos macromoleculares), el tamaño de partícula puede exceder la profundidad de campo a altas resoluciones e introducir errores de fase debido a la aproximación plana de la esfera de Ewald en los algoritmos de reconstrucción 3D estándar³⁶. Estos errores pueden ser refinados por algoritmos avanzados que ya están implementados en paquetes comunes de procesamiento de imágenes crio-EM 37,28,39. Como la esfera de Ewald tiene una curvatura mayor en datos de 200 kV que en datos de 300 kV, la corrección de la esfera de Ewald es necesaria a resoluciones relativamente más bajas y/o para conjuntos macromoleculares relativamente más pequeños cuando se utilizan TEMs de 200 kV. Por otro lado, las imágenes de 200 kV exhiben un mayor contraste de partículas en hielo delgado (20-50 nm) que es significativamente más delgado que la trayectoria libre media de electrones de 200-300 keV (220-280 nm). El mayor contraste ayuda a mejorar la alineación global correcta de partículas individuales, particularmente para dispersar débilmente proteínas más pequeñas cuya estructura aún no se conoce, y el modelo de referencia 3D aún no está bien establecido.

Aquí, demostramos en el ejemplo de un proteasoma 20S que el contraste y la calidad de la imagen podrían mejorarse de manera similar con un filtro de energía cuando se utiliza un microscopio TEM de 200 kV. Utilizando el mismo número de partículas, los datos recopilados utilizando la rendija de 20 eV se reconstruyeron a una resolución de 2,26 Å en comparación con los datos recopilados con la rendija de energía completamente abierta que se reconstruyó solo a una resolución de 2,34 Å. La mejor reconstrucción se logró a partir de los datos recopilados utilizando la hendidura de 10 eV que se reconstruyó a una resolución de 2,14 Å. Estos resultados están de acuerdo con la predicción teórica de que el filtrado de los electrones dispersos inelásticamente aumenta el SNR en las imágenes recogidas y facilita una mayor resolución en las reconstrucciones crio-EM a partir del número dado de partículas, como se resume en la Tabla 4. Estos resultados fueron confirmados por los factores B calculados a partir de estos conjuntos de datos que indican una mayor calidad de las imágenes en los conjuntos de datos filtrados por energía.

Por lo tanto, podemos concluir que, si bien los microscopios TEM de 300 kV ofrecen el mayor rendimiento y la mayor resolución posible en las reconstrucciones crio-EM, los microscopios TEM de 200 kV también proporcionan conjuntos de datos de alta calidad para reconstrucciones crio-EM de alta resolución. Demostramos aquí que la calidad de las imágenes adquiridas, y por lo tanto el tiempo general de estructuración, se puede mejorar aún más mediante el uso del TEM de 200 kV equipado con un filtro de energía y un detector de electrones directo. El Protocolo presentado describe todos los pasos necesarios sobre cómo obtener rutinariamente datos crio-EM de alta resolución utilizando esta configuración y revela detalles estructurales finos de estructuras 3D macromoleculares, que son esenciales para comprender las relaciones clave estructura-función en biología estructural y diseño de fármacos basados en estructuras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anillos AutoGrid	Thermo Fisher Scientific	1036173	Paquete de 100 anillos AutoGrid para las rejillas EM estándar.
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Paquete de 100 clips que aseguran las rejillas EM estándar dentro de los anillos AutoGrid.
Plataforma de gestión de datos	Thermo Fisher Scientific	1160939	parte de la configuración base de Glacios; incluye Athena Software
EPU Quality Monitor	Thermo Fisher Scientific	1179770
EPU Software	Thermo Fisher Scientific	1025080	parte de la configuración base de Glacios
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	Gas etano utilizado para la producción de etano líquido (pureza de al menos N35, es decir, 99,95% vol)
Falcon 4 200kV	Thermo Fisher Scientific	1166936	Detector directo de electrones
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 kV TEM
GloQube Plus Sistema de descarga incandescente para rejillas TEM y modificación de superficies	Quorum	N/A	también disponible a través de Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
Rejillas QuantiFoil	Quantifoil	N/A	R-2/1, malla de 300; rejilla de lámina de carbono
Relion	MRC Laboratorio de Biología Molecular N	/A	software de código abierto: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris con Falcon 4 para 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191753	Filtro de energía
Selectris X con Falcon 4 para 200 kV	Thermo Fisher Filtro	energía	1191755
UltrAuFoil rejillas	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, malla 300; rejillas de lámina de oro
Vitrobot Mk. IV	Thermo Fisher Scientific 1086439		Sistema de vitrificación automatizado
Whatman 595 Papel de filtro Thermo	Fisher Scientific	AA00420S