Microdisección en capas de valvas de válvula tricúspide para caracterización mecánica biaxial y cuantificación microestructural

Resumen

Este protocolo describe la caracterización mecánica biaxial, la cuantificación del colágeno basada en imágenes de dominio de frecuencia espacial polarizada y la microdisección de las valvas de la válvula tricúspide. El método proporcionado aclara cómo las capas de folletos contribuyen a los comportamientos holísticos de los folletos.

Resumen

La válvula tricúspide (TV) regula el flujo unidireccional de sangre no oxigenada desde la aurícula derecha hasta el ventrículo derecho. El televisor consta de tres folletos, cada uno con comportamientos mecánicos únicos. Estas variaciones entre los tres folletos de TV se pueden entender mejor examinando sus cuatro capas anatómicas, que son la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V). Si bien estas capas están presentes en los tres folletos de TV, existen diferencias en sus espesores y constituyentes microestructurales que influyen aún más en sus respectivos comportamientos mecánicos.

Este protocolo incluye cuatro pasos para dilucidar las diferencias específicas de la capa: (i) caracterizar los comportamientos arquitectónicos mecánicos y de fibra de colágeno del folleto de TV intacto, (ii) separar las capas compuestas (A / S y F / V) del folleto de TV, (iii) llevar a cabo las mismas caracterizaciones para las capas compuestas, y (iv) realizar post-hoc evaluación histología. Este marco experimental permite de forma única la comparación directa del tejido tvnte intacto con cada una de sus capas compuestas. Como resultado, se puede recopilar información detallada sobre la microestructura y la función biomecánica de los folletos de TV con este protocolo. Dicha información se puede utilizar potencialmente para desarrollar modelos computacionales de TV que buscan proporcionar orientación para el tratamiento clínico de la enfermedad de TV.

Introducción

El televisor se encuentra entre la aurícula derecha y el ventrículo derecho del corazón. A lo largo del ciclo cardíaco, el televisor regula el flujo sanguíneo unidireccional a través de la apertura y el cierre cíclicos de la valva anterior de TV (TVAL), la valva posterior de TV (TVPL) y la valva septal de TV (TVSL). Estas valvas son complejas y tienen cuatro capas anatómicas distintas: la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V), con constituyentes microestructurales únicos. Las fibras de elastina en el atrialis y el ventricularis ayudan a restaurar el tejido a su geometría no deformada después de la carga mecánica¹. Por el contrario, la fibrosa contiene una densa red de fibras de colágeno onduladas que contribuyen a la capacidad de carga de las valvas². Compuesta principalmente de glicosaminoglicanos, la espongiosa ha sido hipotetizada para permitir el cizallamiento entre las capas de la valva durante la función de la válvula cardíaca³. Si bien los tres tipos de folíolos tienen las mismas capas anatómicas, hay variaciones en los espesores de las capas y las proporciones constituyentes que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos específicos de los folletos.

Los investigadores han explorado las propiedades de los folletos de TV utilizando caracterizaciones mecánicas planas, evaluaciones histomorfológicas y caracterizaciones ópticas de la arquitectura de la fibra de colágeno. Por ejemplo, las caracterizaciones mecánicas biaxiales planas buscan emular la carga fisiológica aplicando desplazamientos perpendiculares al tejido y registrando las fuerzas asociadas. Las observaciones resultantes de desplazamiento de fuerza (o estiramiento por estrés) han revelado que los tres folletos de TV exhiben comportamientos mecánicos no lineales, específicos de la dirección, con respuestas más aparentes específicas de la valva en la dirección del tejido radial ^4,5,6. Se cree que estos comportamientos específicos de la valva se derivan de las diferencias en las propiedades microestructurales observadas utilizando técnicas histológicas estándar ^6,7. Además, las imágenes de segunda generación armónica⁶, la dispersión^{de luz de} ángulo pequeño 8 y la imagen de dominio de frecuencia espacial polarizada⁷ (pSFDI) tienen como objetivo comprender estas propiedades microestructurales y han mostrado diferencias específicas en la orientación de la fibra de colágeno y el engarce de fibra que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos observados a nivel de tejido. Estos estudios han avanzado significativamente nuestra comprensión de la microestructura tisular y su papel en los comportamientos a nivel tisular. Sin embargo, queda mucho por abordar en la conexión experimental de la mecánica de tejidos y la microestructura subyacente.

Recientemente, este laboratorio realizó caracterizaciones mecánicas de las capas de folletos de TV separadas en dos capas compuestas (A/S y F/V) utilizando una técnica de microdisección⁹. Ese trabajo anterior destacó las diferencias en las propiedades mecánicas de las capas y ayudó a proporcionar información sobre cómo la microestructura en capas contribuye a los comportamientos mecánicos de los tejidos. Aunque esta investigación mejoró nuestra comprensión de la microestructura del folleto de TV, la técnica tenía varias limitaciones. En primer lugar, las propiedades de las capas compuestas no se compararon directamente con el tejido intacto, lo que llevó a una falta de comprensión completa de la relación mecánica-microestructura. En segundo lugar, no se examinó la arquitectura de la fibra de colágeno de las capas compuestas. En tercer lugar, solo se investigaron las capas del TVAL debido a las dificultades para recolectar las capas compuestas de los otros dos folletos de TV. El método descrito en este documento proporciona un marco de caracterización holística que supera estas limitaciones y proporciona caracterizaciones completas de los folletos de TV y sus capas compuestas.

Este artículo describe la técnica de microdisección que separa los tres folletos de TV en sus capas compuestas (A/S y F/V) para caracterizaciones mecánicas y microestructurales biaxiales 10,11,12. Este protocolo iterativo incluye (i) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI del folíolo intacto, (ii) una técnica de microdisección novedosa y reproducible para obtener de manera confiable las capas de TV compuestas, y (iii) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI de las capas de TV compuestas. El tejido fue expuesto a carga de tracción biaxial con varias relaciones de fuerza para pruebas mecánicas. Luego, se utilizó pSFDI para determinar la orientación y alineación de la fibra de colágeno en varias configuraciones cargadas. pSFDI conserva la arquitectura nativa de la fibra de colágeno, permite el análisis dependiente de la carga y evita la necesidad típica de fijar o limpiar el tejido para el análisis de la arquitectura de la fibra de colágeno, como en las imágenes de segunda generación armónica o la dispersión de luz de ángulo pequeño. Finalmente, los tejidos se prepararon utilizando técnicas histológicas estándar para visualizar la microestructura tisular. Este marco iterativo y holístico permite la comparación directa de las propiedades mecánicas y microestructurales del folleto de TV con sus capas compuestas.

Protocolo

Todos los métodos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oklahoma. Los tejidos animales fueron adquiridos de un matadero aprobado por el USDA.

1. Caracterización mecánica biaxial

1. Preparación de tejidos
   1. Recupere un folleto de TV del congelador, cuchillas de afeitar, una pluma quirúrgica, fórceps, una pipeta con agua desionizada (DI) y una estera de corte. Descongele el folleto de TV con 2-3 gotas de agua DI a temperatura ambiente.
      NOTA: El agua DI se utiliza en lugar de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para evitar cualquier dificultad inducida por PBS para la microdisección de la capa.
   2. Coloque la muestra plana sobre la estera de corte con la capa ventricularis (es decir, la superficie con las inserciones de cuerdas) mirando hacia arriba. Coloque la muestra de modo que la dirección radial se alinee con la dirección Y y la dirección circunferencial se alinee con la dirección X.
      NOTA: La dirección circunferencial está orientada a lo largo de la circunferencia de la válvula.
   3. Examine las ubicaciones de inserción de cuerdas del tejido. Determine un área, idealmente ~ 12 x 12 mm, con la menor cantidad de inserciones de cuerdas grandes mientras evita áreas extremadamente delgadas (es decir, transparentes) (Figura 1).
   4. Voltee la muestra para que la superficie auricular (es decir, la superficie sin inserciones de cuerdas) esté orientada hacia arriba. Asegúrese de que las direcciones de la valva circunferencial y radial permanezcan alineadas con los ejes X e Y, respectivamente.
   5. Cortar una muestra cuadrada de 12 x 12 mm del tejido de la valva que evite las grandes inserciones de cordas o las áreas delgadas identificadas en el paso 1.1.3. Retire las porciones recortadas del tejido del prospecto con los fórceps y colóquelas en un contenedor de desechos.
      1. Si no es posible evitar por completo las inserciones de cuerdas grandes, corte los tejidos para que estén a lo largo del borde de la muestra cuadrada. Evitar las inserciones de cuerdas es importante, ya que ayuda a prevenir problemas para la microdisección posterior.
   6. Use un bolígrafo quirúrgico para colocar un pequeño punto en la esquina superior derecha para rastrear la orientación de la muestra. Deje que la tinta se seque durante aproximadamente 30 s.
   7. Voltee la muestra con la superficie ventricular (es decir, la superficie con inserciones cordales) mirando hacia arriba. Recorte los accesorios cordales en la parte posterior del tejido estirando las cuerdas del folíolo y usando una cuchilla de afeitar para cortar cerca de su lugar de inserción. Voltee la muestra nuevamente para que la superficie auricular (es decir, la superficie lisa) esté orientada hacia arriba.
2. Medición de espesores
   1. Recupere un sensor de desplazamiento láser sin contacto. Ponga a cero el sensor de desplazamiento en una sección plana de la alfombra de corte cerca del tejido recortado.
      PRECAUCIÓN: No haga brillar directamente el láser en los ojos.
   2. Coloque el láser sobre la región central de la muestra. Retire el aire atrapado debajo de la superficie del prospecto, ya que puede causar errores de medición. Para liberar el aire atrapado, use pinzas para empujar la burbuja hasta el borde del tejido o levante una esquina del tejido.
   3. Registre el grosor que se muestra en la pantalla del sensor de desplazamiento. Repita dos mediciones más en otros lugares de la muestra.
   4. Calcule el espesor medio del folleto utilizando las tres mediciones registradas en el paso anterior. Utilice este valor al crear los protocolos de caracterización mecánica biaxial.
3. Configuración del probador biaxial y montaje de tejidos
   1. Prepare un baño de agua DI a 37 ° C, siguiendo las pautas del sistema de prueba, para garantizar la temperatura en condiciones fisiológicas in vivo .
   2. Recupere fórceps, la muestra de tejido, el hardware de montaje, una herramienta de punta fina, pegamento líquido de cianoacrilato y cuentas de vidrio pintadas de negro (diámetro: 300-500 μm).
      NOTA: El hardware de montaje incluye las púas, el puente de montaje y la goma de montaje.
   3. Monte la muestra de tejido en el sistema de prueba. Asegúrese de que la dirección circunferencial del tejido se alinee con la dirección X, que puede ser asistida por el punto previamente colocado en el paso 1.1.6.
      NOTA: Las puntas utilizadas aquí deben estar espaciadas uniformemente en toda la longitud del borde del tejido. La longitud efectiva del borde se establece en 10 mm para el tejido intacto y >3,3 mm para las capas compuestas.
4. Colocación de marcadores fiduciarios
   1. Identifique la región central de un tercio cuadrado del tejido montado. Utilice las esquinas aproximadas de esta área para la colocación del marcador fiduciario.
   2. Coloque las cuentas de vidrio en un bote de pesaje de cara abierta y cree una pequeña piscina de pegamento líquido de cianoacrilato en un bote de pesaje separado. Cubra la parte superior de la herramienta de punta fina con una pequeña cantidad de pegamento. Frote el exceso de pegamento en el costado del bote de pesaje.
   3. Cree una esquina de la matriz cuadrada central de un tercio presionando suavemente la punta recubierta de pegamento sobre el tejido. Usando fórceps, tome una cuenta de vidrio y colóquela cuidadosamente sobre el punto de pegamento. Utilice la cámara del dispositivo de prueba biaxial para obtener ayuda con la colocación de la perla.
   4. Repita los pasos 1.4.2 y 1.4.3 para tres cuentas adicionales hasta que se complete la matriz cuadrada. Asegúrese de que las cuentas estén bien unidas y que sus respectivos puntos de pegamento no se toquen ni se peguen entre sí. Seque el pegamento antes de bajar el tejido al baño de agua.
      1. Si las cuentas están pegadas, espere a que el pegamento se seque, luego use las pinzas para agarrar suavemente la cuenta o el pegamento y sacarlo del tejido.
         NOTA: El pegamento y la(s) cuenta(s) deben desprenderse, permitiendo que la colocación de la perla sea reacondicionada.
5. Preacondicionamiento
   1. Crear un protocolo de preacondicionamiento controlado por la fuerza, en el que el tejido con longitud y grosor de borde se someterá a seis repeticiones de carga equibiaxial a un _pico T de tensión de membrana pico de 40 N / m con una precarga del 3% × pico T¹⁰ y tiempos de estiramiento y recuperación de 30 s cada uno.
      1. Cree un directorio de pruebas arbitrario que almacenará temporalmente los datos para futuros cálculos. Establezca la velocidad de carga en 4,42 N/m.
      2. Cree un nuevo conjunto de parámetros de prueba con el nombre Preconditioning0. Establezca los modos de control del eje X y del eje Y para forzar y configure las funciones de control en paso. Defina la magnitud de la carga como la fuerza asociada con el_pico T, es decir, el_pico f = _pico T · L. Defina la magnitud de precarga como 3% del _pico f solo para la primera repetición y defina tanto la duración del estiramiento como la duración de la recuperación como 30 s. Defina el número de repeticiones como 10.
         NOTA: El pico calculado primero estrés de Piola-Kirchhoff, es decir, pico P = _pico T / t, puede exceder los 200 kPa para tejidos más delgados, lo que podría resultar en desgarro del tejido durante la prueba. En estos escenarios, la tensión máxima de la membrana se ajustó a una tensión máxima de Piola-Kirchhoff de 200 kPa.
   2. Ejecute el protocolo de preacondicionamiento. Después del acondicionamiento previo, registre las dimensiones X e Y actuales de la muestra para su uso en los protocolos de prueba biaxial.
6. Creación y ejecución de protocolos de pruebas biaxiales
   1. Determine el tiempo necesario para alcanzar la configuración equibiaxial máxima a partir de la configuración post-preacondicionada con la tasa de desplazamiento deseada. Teniendo en cuenta una tasa de desplazamiento constante, calcule los tiempos de carga para las relaciones de carga restantes (es decir, T_XX: T_YY = 1: 0.5 y T_XX: T_YY = 0.5: 1).
   2. Trote manualmente los actuadores lineales para que coincidan con las fuerzas objetivo para una relación de carga determinada. Repita este proceso y registre las dimensiones del folleto para todas las relaciones de carga.
   3. Prepare un protocolo de prueba controlado por desplazamiento que desplace biaxialmente el tejido de la configuración post-preacondicionada a las configuraciones registradas en el paso 1.6.2 (es decir, T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) dentro de los tiempos determinados en el paso 1.6.1. Asegúrese de que cada protocolo tenga tres ciclos de carga/descarga para la repetibilidad del comportamiento mecánico.
      1. Cree un directorio de pruebas que almacenará los datos para futuros cálculos. Asegúrese de que el nombre del directorio coincida con la muestra actual.
      2. Construya un nuevo conjunto de parámetros de prueba con el nombre 1:1, establezca los modos de control del eje X y del eje Y en desplazamiento y establezca las funciones de control en rampa. Defina la magnitud de estiramiento como la configuración registrada en el paso 1.6.1. Defina la magnitud de precarga como el 3% del _pico f solo para la primera repetición, y defina tanto la duración del estiramiento como la duración de la recuperación como el tiempo registrado en el paso 1.6.1. Defina el número de repeticiones como 3.
      3. Repita el paso 1.6.3.2 para las relaciones de carga restantes (es decir, T_XX:T_YY = 1:0.5 y T_XX:T_YY = 0.5:1), excepto que defina la magnitud de precarga como no aplicada. Asegúrese de que la magnitud del estiramiento, la duración del estiramiento y la duración de la recuperación coincidan con los registrados en el paso 1.6.2.
         NOTA: Solo se utilizarán los datos del ciclo final (tercero) para los análisis de estrés y deformación.
   4. Ejecutar los protocolos de desplazamiento controlado. Después de completar la prueba biaxial, devuelva el tejido a sus dimensiones post-preacondicionadas.
      NOTA: La prueba debe abortarse inmediatamente si el tejido comienza a desgarrarse.
7. Otras caracterizaciones
   1. Deje el tejido sumergido en agua DI y montado en el sistema de prueba biaxial. Realice imágenes de pSFDI como se describe en los pasos 2.1-2.3.
   2. Desmonta el tejido. Si se trata de un tejido intacto, proceda a la microdisección descrita en los pasos 3.1-3.7. De lo contrario, recoja la histología siguiendo el paso 3.7.
      NOTA: El baño de agua DI se puede utilizar para caracterizaciones posteriores dentro del mismo día.
   3. Repita los pasos 1.2-1.7 con las capas A/S y F/V adquiridas después de la microdisección (pasos 3.1-3.6).
      NOTA: La repetición del protocolo de prueba para las capas permite la comparación directa del tejido intacto con sus propias capas.
8. Procedimientos de posprocesamiento de datos de pruebas biaxiales
   1. Realice la correlación de imágenes digitales de las imágenes de prueba biaxiales adquiridas para determinar las posiciones de los marcadores dependientes del tiempo. Calcular los desplazamientos del marcador fiduciario a través de Eq (1). ⁵
      (1)
      Aquí, x_i(t), X_i y d_i(t) son la ubicación dependiente del tiempo, la ubicación inicial (referencia) y el desplazamiento del marcador i.
   2. Calcular el gradiente de deformación F considerando los marcadores fiduciales como un elemento finito bilineal de cuatro nodos, como se muestra en Eq (2)⁵
      (2)
      Donde B_Xi y B_Yi son las derivadas de las funciones de forma para el nodo i en las direcciones X e Y, respectivamente, y u_i(t) y v_i(t) son los componentes de d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. Calcular la primera tensión de Piola-Kirchhoff aplicada P utilizando las fuerzas registradas, como en Eq (3)⁵
      (3)
      P_XX y P_YY son los componentes X e Y de P; L y t son la longitud y el grosor del borde del tejido; f_X y f_Y son las fuerzas registradas en las direcciones X e Y.
   4. Determine otras medidas de tensión y tensión según sea ^necesario,13 que incluyen la deformación derecha de Cauchy-Green C = F^T / F, la cepa de Green-Lagrange E = (C - I) / 2, la σ de tensión de Cauchy = ^J-1PF^T y la segunda tensión de Piola-Kirchhoff S = ^F-1P.
      NOTA: Aquí, I es un tensor de identidad de segundo orden, y J = det(F) es el jacobiano del gradiente de deformación F.

2. Imágenes de dominio de frecuencia espacial polarizada

1. Preparación del sistema
   NOTA: Si se desea, los marcadores fiduciarios se pueden eliminar del tejido antes de los siguientes pasos.
   1. Centrar el dispositivo pSFDI sobre la muestra (Figura 2). Encienda el proyector e ilumine la muestra con luz de 490 nm (cian).
   2. Abra el software de la cámara e inspeccione el campo de visión de la cámara. Asegúrese de que la muestra esté centrada en el marco y esté completamente contenida dentro del campo de visión.
   3. Si la muestra montada es un folleto intacto, ajuste el brillo del proyector de procesamiento de luz digital (DLP) para asegurarse de que el tejido esté completamente iluminado sin deslumbramientos en la superficie del tejido. No ajuste el brillo si la muestra es una de las capas compuestas.
   4. Gire el polarizador a través de todo su rango de movimiento para detectar posibles deslumbramientos o suciedad en la lente del polarizador. Limpie cuidadosamente la lente polarizadora con un paño de microfibra según sea necesario.
2. Recogida de datos
   NOTA: La siguiente recopilación de datos se puede automatizar mediante software, como LabVIEW o Python.
   1. Mueva el polarizador a su posición de inicio, idealmente alineada con uno de los ejes de prueba biaxiales. Capture una imagen en escala de grises y guárdela en la computadora con la ubicación del polarizador (es decir, 0 °).
   2. Gire el polarizador 5° y capture otra imagen en escala de grises. Repita este proceso para adquirir 37 imágenes que van de 0° a 180° con un incremento de 5°.
      NOTA: Las imágenes de la primera secuencia de imágenes pSFDI se pueden analizar preliminarmente para garantizar la respuesta óptica deseada del tejido. Consulte el paso 2.3 para obtener instrucciones.
   3. Repita la secuencia de imágenes pSFDI para otras configuraciones de tejido deseadas, por ejemplo, las configuraciones de pico de los protocolos de carga considerados para las pruebas mecánicas biaxiales.
3. Procedimientos de posprocesamiento de datos pSFDI
   Nota : el método siguiente incluye pasos para el lenguaje de programa MATLAB. Sin embargo, se puede usar cualquier lenguaje preferido (por ejemplo, Python, C ++) en su lugar.
   1. Utilice la función imread() de MATLAB para construir matrices que contengan las intensidades en píxeles de las 37 imágenes adquiridas. Para mayor comodidad, organice estos como un n × m × 37 matriz tridimensional, donde n y m son los números de píxeles a lo largo de los dos ejes.
   2. Defina la región tisular de interés (ROI) utilizando la función grabit() definida por el usuario.
   3. Ajuste los datos de intensidad frente a los del ángulo del polarizador para cada píxel de ROI utilizando una serie de Fourier de 3 términos, como en Eq (4):
      (4)
      Aquí, I(θ) es la intensidad en píxeles en función del ángulo del polarizador, y b_i son las constantes de Fourier. Utilice la regresión lineal estándar de mínimos cuadrados para determinar b_i.
   4. Determine la orientación de la fibra en píxeles como el ángulo del polarizador asociado con el valor máximo de I(θ). Calcular el grado de anisotropía óptica (DOA) a través de Eq (5).
      (5)
   5. Utilice plot() e histograma() para visualizar la orientación de la fibra adquirida y los valores de DOA. Guarde los resultados procesados para su uso posterior.

3. Microdisección de capas compuestas de valvas de válvula tricúspide

1. Fijación de tejido a la tabla de cera
   1. Reúna los materiales requeridos: tablero de cera, agua DI, pipeta, bisturí, micro tijeras, pinzas delgadas, pinzas curvas, pinzas gruesas y pasadores.
      NOTA: Solo use pinzas sin dientes ni agarres, ya que las pinzas de este tipo pueden rasgar muy fácilmente el tejido delgado de la capa A / S al realizar la disección.
   2. Desmonte el tejido del probador biaxial y mida su grosor utilizando el sensor de desplazamiento láser descrito en el paso 1.2. Coloque el pañuelo en la tabla de cera.
   3. Examine el lado ventricularis del tejido en busca de inserciones de cuerdas grandes. Nótese la posición de estas inserciones para evitarlas durante la disección (Figura Suplementaria S1). Tome una fotografía como referencia.
   4. Extienda el tejido plano sobre la tabla de cera con el auricular hacia arriba. Fije el tejido a la tabla usando los pines:
      1. En cada esquina del tejido, coloque un alfiler que esté en ángulo lejos del tejido (para una mejor visualización) y tire ligeramente del tejido tenso (Figura 3A). Haga esto en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj. Asegúrese de que los pasadores estén fuera de los orificios creados por las púas al montar el tejido.
      2. Ajuste ligeramente la colocación del pasador para asegurarse de que el tejido esté tenso y en una configuración cuadrada (Figura 3B) para que el tejido quede plano y no se desplace durante la microdisección de la capa.
      3. Si es necesario, coloque alfileres a lo largo del costado del tejido durante la disección para estirar más el tejido. Tenga en cuenta al colocar y pescar pasadores adicionales que deben ser trabajados durante la disección.
      4. Retire los marcadores fiduciarios de cuentas de vidrio.
         NOTA: El siguiente paso es opcional. El agua DI añadida ayuda a mantener la hidratación del tejido y evita que el tejido se pegue a sí mismo a lo largo de la microdisección.
      5. Usando una pipeta, coloque agua DI en la superficie del tejido para que cubra completamente el tejido de una manera similar a una burbuja. Reponga el agua di según sea necesario durante toda la disección.
2. Haz la esquina inicial.
   1. Seleccione una esquina de la muestra fijada para comenzar la disección. Evite las inserciones de cuerdas grandes y las áreas extremadamente delgadas.
   2. Haga un corte en la capa A / S arrastrando ligeramente el bisturí sobre la superficie del tejido a lo largo de los orificios de montaje de las pruebas mecánicas (Figura 3C). Asegúrese de que el corte tenga al menos 5 mm de largo y que los bordes del corte comiencen a separarse, revelando la capa F / V debajo.
   3. Use las pinzas delgadas (sin una punta afilada) para frotar firmemente a lo largo del corte y separar los bordes del corte (Figura suplementaria S2).
      1. Si el corte en la capa A / S no comienza a separarse, vuelva a trazar ligeramente sobre el mismo corte con el bisturí hasta que comience a hacer esto. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente en el tejido (más allá de la capa compuesta A / S), ya que hace que sea más difícil separar limpiamente las capas.
   4. Repita los pasos 3.2 y 3.2.3 para hacer un segundo corte perpendicular al primer corte (Figura 3D). Asegúrese de que los dos cortes estén conectados y formen una esquina.
      1. Si los dos cortes no están conectados, coloque las pinzas delgadas debajo de la pequeña área de tejido que separa los dos cortes (Figura suplementaria S3). Luego, use cuidadosamente las tijeras para cortar el tejido.
3. Pelar el tejido de la esquina.
   1. Frote a lo largo de los cortes con las pinzas delgadas hasta que el tejido comience a separarse de la capa F / V. Tan pronto como se separe un pequeño trozo de tejido, agárrelo con las pinzas y tire suavemente de él para separar aún más las capas compuestas.
      NOTA: Siempre coloque la punta de las pinzas delgadas más allá del borde del tejido al agarrar. De lo contrario, podrían perforar accidentalmente un agujero en la capa compuesta A / S.
   2. Continúe pelando el pañuelo y frote la costura hasta que llegue al final de los dos cortes realizados para la esquina. A lo largo de este proceso, cambie a pinzas más grandes para agarrar el tejido para el proceso de pelado para evitar el desgarro y desgarro no deseado de la capa compuesta A / S.
      1. Si la primera esquina intentada tiene problemas importantes con la separación, pruebe una esquina diferente como punto de partida (vuelva al paso 3.2).
4. Extiende los cortes, pela el pañuelo y haz una segunda esquina.
   1. Extienda los dos cortes realizados para la primera esquina colocando la punta del bisturí en la parte inferior de cada corte y arrastrándola ligeramente a lo largo de la superficie del tejido (Figura 4A). Asegúrese de que todos los cortes de extensión sean de al menos 5 mm y que las extensiones de corte se conecten a los cortes originales y continúen siguiendo los orificios de sutura o sutura.
      NOTA: Si el corte de extensión es demasiado profundo, entonces el próximo peeling debe ser monitoreado de cerca para garantizar que las secciones de la fibrosa no estén separadas con la capa compuesta A / S (Figura 5A).
   2. Continúe extendiendo los cortes y pele la capa superior compuesta A / S hacia atrás mientras frota la costura hasta que un lado esté terminado. Observe que el tejido se separará completamente a lo largo de un corte; asegúrese de que la costura entre las capas compuestas A/S y F/V sea recta (Figura 4B).
   3. Repita las instrucciones de los pasos 3.2 y 3.3 para crear una segunda esquina perpendicular al extremo del lado completamente pelado (Figura 4C).
5. Separe completamente la capa A / S.
   1. Extienda los cortes restantes mientras evita inserciones de cuerdas grandes. Continúe separando las capas A / S y F / V utilizando las técnicas de frotamiento y tracción empleadas para la primera esquina. Tome nota de varias consideraciones o problemas que pueden surgir durante este proceso:
      1. Excluir las inserciones de cuerdas del área de separación A/S (Figura 5B) solo cuando esta exclusión permita una muestra A/S lo suficientemente grande como para caracterizaciones experimentales (>3,3 mm).
      2. Si el tejido se desgarra o se forma un agujero, deje de separar el tejido inmediatamente. Para evitar que las pinzas queden atrapadas, coloque las tijeras en cualquier orificio que se forme y corte el tejido lejos del centro. Si el defecto se forma a lo largo de la costura de separación, comience a separar el tejido a lo largo de otro borde para evitar un mayor desgarro (Figura 5C).
      3. Busque las conexiones entre capas que puedan aparecer al separar el tejido y evite una mayor separación del tejido sin un alto riesgo de desgarro (Figura 5D). Observe que estas son hebras delgadas pero fuertes que deben cortarse cuidadosamente con tijeras. Evite crear un orificio en la capa A / S o cortar hacia abajo en la capa F / V, ya que esto causaría una separación desigual.
      4. Continúe este proceso hasta que se haya separado la muestra más grande posible de la capa A/S. Marcar la orientación de la muestra utilizando la pluma quirúrgica (Figura 6A).
6. Terminar la disección.
   1. Use las tijeras para cortar a lo largo de la costura de separación para el borde de tejido restante (Figura 6B). Asegúrese de que este corte esté lo más cerca posible de la costura de separación.
   2. Coloque la capa compuesta A/S separada plana sobre la estera de corte. Si es necesario, use el bisturí para enderezar los bordes del tejido y crear una forma de tejido cuadrado adecuada para las pruebas mecánicas biaxiales. Coloque la capa A / S en agua DI hasta que esté lista para ser probada.
   3. Marque la orientación de la capa F/V que permanece en la tabla de cera. Corte el cuadrado más grande posible del área donde se eliminó la capa A / S (Figura 6C), luego colóquelo en agua DI.
7. Histología
   1. Extirpar dos tiras de tejido, alineadas con las direcciones circunferencial y radial, para su uso en histología. Utilice diferentes protocolos para las capas intactas y compuestas (es decir, A / S y F / V).
      1. Para la capa intacta, tome las muestras del tejido que permanece fijado a la tabla de cera. Use el tejido fuera de los orificios de sutura, ya que esta porción del tejido no ha sido diseccionada y representará el folíolo intacto.
      2. Para las capas compuestas A / S y F / V, solo recoja muestras histológicas después de completar completamente sus pruebas e imágenes. Desmonte la muestra del sistema de prueba biaxial, coloque el tejido plano sobre una estera de corte y elimine las tiras circunferenciales y radiales con una cuchilla de afeitar.
   2. Coloque las tiras extirpadas en casetes de tejido y sumerja los casetes en formalina al 10%.
   3. Deseche el tejido restante. Limpie las herramientas de disección utilizando un compuesto de limpieza (consulte la Tabla de materiales).
   4. Después de 24-48 h de fijación, transfiera los casetes a etanol, donde se pueden almacenar indefinidamente hasta el procesamiento histológico y la tinción.
      NOTA: Este análisis histológico puede confirmar que la microdisección es exitosa. PRECAUCIÓN: El 10% de formalina causa irritación de la piel y daño ocular grave. También puede causar una reacción alérgica o cáncer por inhalación. Al manipular, use el equipo de protección personal adecuado, como guantes, gafas y una bata de laboratorio, y úselo solo en espacios bien ventilados, como en una campana extractora de humos. Cuando no esté en uso, asegúrese de que el recipiente de almacenamiento esté bien cerrado.

Resultados

La microdisección producirá muestras A/S y F/V con espesores relativamente uniformes que se pueden montar en un dispositivo de prueba biaxial (comercial). El análisis histológico de la valva intacta y las dos capas diseccionadas verificará si el tejido se separó correctamente a lo largo del borde entre la espongiosa y la fibrosa (Figura 7). Además, las micrografías histológicas se pueden utilizar para determinar los espesores de las capas de tejido y las fracciones de masa constituyente util...

Discusión

Los pasos críticos para el protocolo incluyen: (i) la microdisección de la capa, (ii) el montaje del tejido, (iii) la colocación del marcador fiduciario y (iv) la configuración de pSFDI. La microdisección de capas apropiada es el aspecto más importante y difícil del método descrito en este documento. Antes de iniciar una investigación que utilice esta técnica, el disector (s) debe tener práctica a largo plazo con la técnica de microdisección y los tres folletos de televisión. El disector debe asegurarse de que las muestr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de formalina al 10%, tamponada neutra	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Detergente Alconox	Compuesto de limpieza	Alconox
BioTester - Probador biaxial	CellScale Biomaterials Testing		1,5 N Capacidad de la célula de carga
Tapete de corte	Dahle	B0027RS8DU
Agua desionizada	N/A
Herramienta de punta fina	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Pinzas - Curvas	Pinzas de laboratorio científicas	16122
- Cerámicas	de laboratorio científicas gruesas	Pinzas 161001078
- Cerámicas científicas delgadas		16127
LabJoy	CellScale Biomateriales Pruebas	versión 10.66
Desplazamiento láser Sensor	Keyence	IL-030
Pegamento de cianoacrilato líquido	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	versión 2020a
Micro Tijeras	HTI Instruments	CAS55C
Pipeta	Belmaks	360758081051Y4
Dispositivo de imagen de dominio de frecuencia espacial polarizado	N/A		Fabricado internamente con un proyector de luz digital, un polarizador lineal, una montura de polarizador giratorio y una cámara de dispositivo de carga acoplada. Consulte doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) para obtener más detalles.
Bisturí	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Hojas de afeitar industriales de un solo filo (acero al carbono quirúrgico)	Pluma quirúrgica VWR International	H3515541105024
	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Fuente comercial	BSN32351
Tablero de cera	N/A		Hecho internamente con cera para modelar y bandeja para hornear
Barco de pesaje	Pure Ponta	mdo-azoc-1030