Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

Resumen

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Resumen

Con abundantes investigaciones sobre células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) publicadas a lo largo de los años, se sabe ampliamente que las ILC2 están implicadas en la regulación de diversos procesos patológicos, incluida la inmunidad antihelmintos, la reparación de tejidos, la termogénesis y las enfermedades autoinmunes como el asma y la rinitis alérgica (AR). Las ILC2 residen permanentemente en tejidos periféricos como la piel, el intestino, los pulmones y la cavidad nasal; Sin embargo, hay información limitada sobre sus funciones exactas en la inmunidad de la mucosa nasal. CD226 es una molécula coestimuladora activadora, expresada principalmente en células asesinas naturales (NK), células T y monocitos inflamatorios. Sin embargo, sigue sin conocerse si las ILC2 expresan CD226 o desempeñan un papel en la patogénesis de las enfermedades relacionadas con ILC2. Aquí, establecimos un método para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal y detectamos la expresión de CD226 en ILC2s obtenidas de ratones sanos y AR. Aquí, describimos este protocolo para el aislamiento e identificación de ILC2 de la mucosa nasal del ratón, que ayudará a explorar el mecanismo patológico interno de los trastornos inmunológicos en las enfermedades de la mucosa nasal.

Introducción

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se descubrieron por primera vez en los tejidos de la cavidad peritoneal de ratones y posteriormente se demostró que estaban presentes en la sangre y otros tejidos periféricos como los pulmones, la piel y la cavidad nasal ^1,2,3. Como células residentes en tejidos, las ILC2 se mantienen y proliferan principalmente localmente y funcionan como los primeros protectores que responden a estímulos dañinos exógenos mediante la producción de numerosas citoquinas tipo 2 e induciendo inmunidad tipo 2

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Pautas de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Científica de la Cuarta Universidad Médica Militar (Nº 20211008).

1. Establecimiento del modelo Murine AR

1. Alojar ratones machos y hembras C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) de 8 a 12 semanas en condiciones específicas libres de patógenos y proporcionar comida y agua estándar de laboratorio.
2. Emulsionar 50 μg de ovoalbúmina (OVA) en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio en un banco li....

Resultados

Se desarrolló un modelo murino inducido por OVA para explorar el papel de ILC2s en AR. La construcción del modelo murino AR se basó en estudios previos con ligeras modificaciones 28,29,30,31. Se capturó un video de 10 minutos para medir la frecuencia de los estornudos y el rascado nasal después del último desafío nasal. Los síntomas alérgicos de los ratones AR inducidos por OVA se presentaron e.......

Discusión

Las ILC2 están estrechamente asociadas con la inflamación tipo 2 y los trastornos inflamatorios, como lo demuestra un número creciente de estudios. Tanto los modelos de ratón como la observación humana contribuyen a una mejor comprensión de su función en las vías respiratorias superiores. En la fisiopatología del asma, las ILC2 se activan a través de la linfopoyetina del estroma tímico, IL-25 e IL-33, que son producidas principalmente por células epiteliales. Luego, reflejando las células Th2, las ILC2 producen IL-4, IL-.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hidróxido de aluminio	Meilun tecnología biológica	21645-51-2
CD11b	eBioscience	11-0112-82	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD11c	BioLegend	117306	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD16/32	BioLegend	101302	Clon: 93; Dilución 1:100
CD226	BioLegend	128812	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD3e	BioLegend	100306	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD45	BioLegend	103128	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD45R	eBioscience	11-0452-82	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
CD90.2	BD Pharmingen	553014	Utilizado en anticuerpo coctail
Colagenasa IV	DIYIBio	DY40128
CountBright cuentas de conteo absolutas	Invitrogen	C36950	cuentas de conteo absolutas
Dnase	Beyotime	D7076
Suero Fetal Bovino	gibco	10270-106
Tinte de viabilidad fijable eFluor 520 (FITC)	eBioscience	65-0867-14	FVD
HBSS, calcio, magnesio	Servicebio	G4204-500
KLRG1	eBioscience	17-5893-81	Utilizado en el cóctel de anticuerpos
NaN3	SIGMA	S2002
Software NovoExpress	AgilentTechnologies	versión 1.5.0	software de análisis de citometría de flujo (FCM)
OVA	SIGMA	9006-59-1
PBS, 1x	Servicebio	G4202-500
PBS, 10x	Servicebio	G4207-500
Percoll	Yeasen	40501ES60	densidad medios de gradiente
RPMI 1640 medios de cultivo	Corning	10-040-CVRV
Analizador de células espectrales	SONY	SA3800