Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

Summary

El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

Abstract

Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.

Introduction

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento ^1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para realizar sus funciones. Sin embargo, todavía se debate si los cambios en las propiedades físicas de la pared celular determinan el destino celular ^2,3,4. Debido a que las células vegetales no se mueven durante el desarrollo, la forma final de un órgano depende de qué tan lejos y en qué dirección se expande una célula. Por lo tanto, la raíz de Arabidopsis es un buen modelo para estudiar el impacto de las propiedades físicas de la pared celular en la expansión celular porque se producen diferentes tipos de expansión en diferentes regiones de la raíz. Por ejemplo, la expansión anisotrópica es evidente en la zona de elongación y particularmente notable en las células epidérmicas⁵.

El método descrito aquí se utilizó para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas a nanoescala de raíces vivas de Arabidopsis utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio de fase de fluorescencia invertida⁶. Para una revisión extensa de la técnica AFM, lea ^7,8,9.

Este protocolo describe un método básico de preparación de muestras y un método general para mediciones de elasticidad basadas en AFM de paredes celulares vegetales.

Figura 1: Resumen esquemático del experimento de indentación de fuerza en raíces de Arabidopsis utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El esquema ofrece una visión general de los pasos de un experimento de Fuerza-Indentación desde la preparación del sustrato para inmovilizar firmemente la muestra de raíz (1-2), la confirmación de la viabilidad de la raíz a través de la tinción de yoduro de propidio (3), el posicionamiento en voladizo en la superficie de una célula epidérmica alargada de la raíz primaria (4-5), la medición de curvas de fuerza (6) y el procesamiento de la curva de fuerza para calcular el módulo de Young aparente (7-8). EZ: zona de elongación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Preparación del material vegetal y condiciones de crecimiento

1. Para generar el material vegetal necesario, esterilice las semillas de tipo salvaje Arabidopsis y líneas mutantes de interés.
   NOTA: En este protocolo, utilizamos lo siguiente: ttl1: líneas de inserción de ADN-T Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo salvaje; el mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste en una mutación knock-out (Q720stop) en el gen CESA6 (AT5G64740), como se describió previamente en^10,11; y TTL1 x PRC1-1 doble mutante.
   1. Poner un volumen aproximado de 50 μL de semillas en un microtubo. Añadir 500 μL de etanol al 70% + solución de Tween al 0,01% a temperatura ambiente. Mezclar e incubar durante 7 min.
   2. Vierta la solución de etanol y agregue 500 μL de hipoclorito de sodio al 20%. Mezclar e incubar durante 7 min.
   3. Vierta la solución de hipoclorito de sodio y lave las semillas de tres a cuatro veces con agua estéril.
2. Enchapado
   1. Preparar de antemano el medio basal Murashige y Skoog (MS)¹² + 1,5% sacarosa + 1% agar (pH 5,7) (ver Tabla de materiales). Autoclave el medio. Prepare una campana de flujo laminar para trabajar en un ambiente estéril y etiquete las placas de Petri cuadradas necesarias para el experimento. Vierta el medio en las placas de Petri y permita que el medio se solidifique.
   2. Emplatar las semillas esterilizadas con puntas de pipeta estériles sobre placas de Petri cuadradas que contengan el medio. Distribuye las semillas uniformemente en dos filas. Cuando las semillas estén secas, cierre las tapas y selle los platos. Estratificar las semillas a 4 °C en la oscuridad durante 4 días.
      NOTA: La estratificación es necesaria para sincronizar la germinación.
   3. Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en régimen de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad) con 25 μmol m² s⁻¹ de intensidad de luz y 23 °C (día/noche). Cultiva las plántulas durante 7 días.

2. Tratamiento del estrés osmótico (opcional)

NOTA: Esta sección proporciona detalles sobre el crecimiento de las raíces de Arabidopsis en el potencial osmótico de -1.2 MPa según lo estimado por el osmómetro crioscópico (Tabla de materiales). Esta parte puede ser omitida o cambiada dependiendo de la pregunta experimental en cuestión.

1. Preparar MS basal medio + 1,5% sacarosa + 400 mM manitol + 1% agar (pH 5,7). Autoclave el medio. Vierta el medio en placas de Petri cuadradas en la campana de flujo laminar y permita que el medio se solidifique.
2. Con pinzas (Tabla de materiales), coloque las plántulas de 5 días de edad precultivadas en MS basal + 1.5% de medio de sacarosa en placas de Petri cuadradas que contengan el medio complementado con manitol de 400 mM. Colocar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones que en el paso 1.2.3. Cultive las plántulas bajo esta condición de estrés osmótico durante 7 días.
   NOTA: Para evaluar la adaptación al crecimiento radicular de la raíz primaria durante el estrés osmótico severo, se sugiere utilizar plántulas 5 días después de la germinación cultivadas en condiciones controladas para asegurar que el tamaño del meristemo de la raíz ya esté establecido¹³. Alternativamente, el análisis se puede realizar en cada etapa del desarrollo para determinar el efecto en el desarrollo de la acción del estrés osmótico.

3. Experimentos de nanoindentación de microscopía de fuerza atómica (AFM)

1. Preparación de la muestra para experimentos de nanoindentación
   NOTA: Este es un paso crucial para aplicar AFM al estudio de muestras biológicas vivas. La muestra debe estar firmemente unida al sustrato para que sea mecánicamente estable durante las mediciones de indentación. Al mismo tiempo, deben preservarse las cualidades estructurales de la muestra. Una estrategia efectiva para estabilizar una muestra grande para AFM es usar adhesivos. El adhesivo debe secarse rápidamente y no debe ser tóxico ni reactivo con el medio circundante. En este protocolo, se utilizaron placas de Petri de poliestireno como sustrato y se utilizó pegamento de silicona no ácida (Tabla de materiales) para unir las plántulas de Arabidopsis.
   1. Extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos. Dejar el pegamento en el aire durante 45 s.
   2. Con pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento, orientándola en una dirección que evite el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego, presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Deje la plántula en contacto con el pegamento durante 45 s antes de continuar con los siguientes pasos del protocolo.
   3. Incubar las plántulas adheridas con 2 μg/ml de yoduro de propidio (PI; Tabla de materiales) durante 5 minutos en la oscuridad y lavarlos cuidadosamente tres veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Tabla de materiales).
   4. Coloque las plántulas incubadas con PI en un microscopio de fluorescencia invertido junto con el AFM. Para observar la fluorescencia, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 572 nm y 617 nm, respectivamente. La ausencia de fluorescencia dentro de las células epidérmicas confirma la viabilidad de las raíces.
   5. Cubra la plántula con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Protocolo de sangría
   NOTA: Realice todas las mediciones de AFM dentro de 1 h después de la inmovilización de la muestra en su soporte a temperatura ambiente. La habitación donde se encuentra el AFM debe mantenerse a 25 °C con aire acondicionado. La solución de PBS debe estar a la misma temperatura.
   1. Monte un voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal (consulte Tabla de materiales) en el soporte de la sonda AFM para fluido (Tabla de materiales).
   2. Alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. A continuación, mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector.
   3. Para calibrar la sensibilidad a la deflexión, coloque una placa de Petri de poliestireno con 1x PBS debajo del AFM.
      NOTA: Este paso es necesario para calcular la sangría. Cuando se realiza una medición de fuerza en una superficie dura, no hay hendidura en la superficie, por lo que cualquier cambio en el desplazamiento del escáner z corresponde a la deflexión en voladizo. Por lo tanto, es muy importante calibrar la sensibilidad a la deflexión en una superficie dura. El uso de una superficie blanda sobrestimará la sensibilidad a la deflexión, lo que dará como resultado constantes de resorte que son demasiado bajas.
   4. Ajuste el fotodetector de modo que la deflexión sin contacto esté cerca de 0 V. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura (curva de fuerza), con un tamaño de rampa de 3 μm, una tasa de indentación y retracción de 0,6 μm/s y un umbral de activación de 0,5 V.
   5. Para calibrar la constante de resorte del voladizo, utilice la utilidad Thermal Tune del software AFM (Tabla de materiales) recomendada para sondas con constantes de resorte inferiores a aproximadamente 5 N/m o utilice el método descrito en la referencia¹⁴. Antes de activar Thermal Tune en el software, asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra.
      1. Introduzca la temperatura del voladizo. Haga clic en Calibrar > Thermal Tune o en el icono Thermal Tune en la barra de herramientas de NanoScope . Seleccione un rango de frecuencia (1-100 Hz).
      2. Haga clic en Adquirir datos en el panel Thermal Tun. Espere a que el AFM adquiera datos y luego haga clic en el botón Oscilador armónico simple (fluido ).
      3. Ajuste el ancho del filtro mediano a 3. Ajuste el ancho de la bandeja PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos mediante el promedio. Establezca límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.
      4. Haga clic en Calcular constante de resorte k y, a continuación, haga clic en Sí en la ventana emergente que le pregunta si el usuario desea utilizar este valor.
      5. Repita los pasos descritos anteriormente tres veces y tome manualmente un promedio de los valores constantes de resorte. Introduzca este valor medio en el cuadro Constante de resorte de la lista de parámetros de rampa de la vista PicoForce . La calibración finaliza en este punto.
   6. Usando el microscopio óptico invertido con un aumento de 10x, 20x y 40x, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria, asegurándose de colocarla en el centro de la célula.
   7. Con el valor constante de resorte calculado (paso 3.2.5.5), obtenga curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 μm, un umbral de activación de 11 nN y una tasa de indentación y retracción de 0.6 μm/s en puntos seleccionados.
      NOTA: El trabajo anterior^15,16 encontró que la baja frecuencia de indentación y retracción ayuda a minimizar la histéresis y la fuerza de arrastre.
   8. Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento (use tres réplicas biológicas por tratamiento). Captura al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz.

4. Medir el módulo aparente de Young

1. Ajuste cada curva de fuerza al siguiente modelo para penetradores piramidales¹⁷: , donde E es el módulo de Young aparente de la muestra, es el módulo de Poisson de la muestra y α es el semiángulo al vértice. Descartar los ajustes con un coeficiente de correlación (r²) < 0,99. Considere la relación de Poisson para material totalmente incompresible: = 0.5 y la geometría del penetrador dada por los fabricantes.
   NOTA: Utilice los primeros 100 nm desde el punto de contacto de la curva de carga para que el accesorio sea lo más sensible posible a la mecánica de la pared celular y para reducir el impacto de la presión de turgencia en los valores aparentes del módulo de Young⁸. El ajuste se ha realizado utilizando un programa personalizado de MATLAB (disponible a petición personal escribiendo a J. C. B) que permite establecer una profundidad de hendidura específica desde el punto de contacto de la curva de carga.
2. Cree un histograma normalizado con los datos del módulo de Young aparente y ajústelo con una distribución gaussiana. Descarte los puntos de datos fuera del intervalo de confianza del 95% y vuelva a calcular tanto el histograma como el ajuste gaussiano. Calcular y reportar la media y la desviación estándar del módulo de Young aparente.
3. Determinar la importancia de las comparaciones entre grupos mediante múltiples pruebas de comparación como ANOVA.

Results

Experimentos de forzamiento-sangría
El siguiente texto presenta algunos resultados esperados cuando se realiza un experimento de sangría forzada para mostrar la salida típica que se espera cuando el protocolo está bien ejecutado.

Curvas fuerza-desplazamiento
En la Figura 2 se presentan gráficas representativas de indentación de fuerza que se obtuvieron sangrando de muestras vivas en una posición colocada en el centro de la c...

Discussion

La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio ^2,3...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)			Incluye cloruro de sodio y tampón de fosfato y está formulado para prevenir el choque osmótico y mantener el equilibrio hídrico en las células vivas.
Software AFM	Bruker, Billerica, MA, EE. UU
Microscopía de fuerza atómica (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Soporte de sonda-fluido	Bruker, Billerica, MA, EE. UU	CAT-FCH	Un soporte de sonda para el catalizador Bioscope, diseñado para el funcionamiento de fluidos en contacto o en modo de golpeo. También es compatible con el funcionamiento por aire.
Osmómetro crioscópico; modelo OSMOMAT 030	Gonotech, Berlín, Alemania
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Concentración original, (1962)
Microscopio óptico invertido acoplado al AFM	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina	100429	Pegamento de silicona neutro, no ácido
Placas de Petri	Deltalab	200201.B	Poliestireno, 55 x 14 mm, estéril por radiación.
Yoduro de propidio	Sigma	P4170	Para prueba de viabilidad radicular.
Sonda de nitruro de silicio, DNP-10, voladizo A	Bruker, Billerica, MA, EE. UU	. DNP-10/A	Para microscopía de modulación de fuerza en operación líquida. Radio de la punta de la sonda de 20-60 nm. 175-μ voladizo triangular de m-largo,  con una constante de resorte de 0,35 N/m.
Pinzas	Sigma	T4537