CUT&RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&RUN unicelular.
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Artículo de método
Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa
En este artículo
Resumen
Resumen
Determinar las ubicaciones de unión de una proteína en la cromatina es esencial para comprender su función y los posibles objetivos reguladores. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para determinar la localización de proteínas durante más de 30 años y se define por el uso de un anticuerpo para extraer la proteína de interés de la cromatina sonicada o digerida enzimáticamente. Más recientemente, las técnicas de anclaje de anticuerpos se han vuelto populares para evaluar la localización de proteínas en la cromatina debido a su mayor sensibilidad. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) es el derivado de todo el genoma del inmunoaprestigio de cromatina (ChIC) y utiliza la proteína A recombinante unida a la nucleasa microcócica (pA-MNasa) para identificar la región constante IgG del anticuerpo dirigida a una proteína de interés, lo que permite la escisión específica del sitio del ADN que flanquea la proteína de interés. CUT&RUN se puede utilizar para perfilar modificaciones de histonas, factores de transcripción y otras proteínas de unión a la cromatina, como los factores de remodelación de nucleosomas. Es importante destacar que CUT&RUN se puede utilizar para evaluar la localización de proteínas asociadas eucromáticas o heterocromáticas y modificaciones de histonas. Por estas razones, CUT&RUN es un método potente para determinar los perfiles de unión de una amplia gama de proteínas. Recientemente, CUT&RUN ha sido optimizado para el perfil del factor de transcripción en poblaciones bajas de células y células individuales y el protocolo optimizado se ha denominado CUT&RUN de entrada ultra baja (uliCUT&RUN). Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de factor de una sola celda utilizando uliCUT& RUN en un formato manual de 96 pocillos.
Introducción
Muchas proteínas nucleares funcionan interactuando con la cromatina para promover o prevenir actividades basadas en plantillas de ADN. Para determinar la función de estas proteínas que interactúan con la cromatina, es importante identificar las ubicaciones genómicas en las que se unen estas proteínas. Desde su desarrollo en 1985, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para identificar dónde se une una proteína a la cromatina 1,2. La técnica chIP tradicional tiene el siguiente flujo de trabajo básico: las células se cosechan y se reticulan (generalmente con formaldehído), la croma....
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Protocolo
Declaración de ética: Todos los estudios fueron aprobados por la Oficina Institucional de Bioseguridad de Protecciones de Investigación de la Universidad de Pittsburgh.
1. Prepara cuentas magnéticas
NOTA: Realice antes de la clasificación de celdas y mantenga el hielo hasta su uso.
- Pipetear 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA mezcla de lodo de perlas por reacción a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml y agregar 850 μL de binding buffer, pipeteando suavemente para mezclar.
NOTA: Las microesferas paramagnéticas conjugadas con A son perlas magnéticas recubiertas de....
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Resultados
Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de proteínas unicelulares en cromatina utilizando un formato manual de 96 pocillos uliCUT&RUN. Si bien los resultados variarán según la proteína que se perfila (debido a la abundancia de proteínas y la calidad de los anticuerpos), el tipo de célula y otros factores contribuyentes, los resultados anticipados para esta técnica se discuten aquí. La calidad celular (apariencia celular y porcentaje de células viables) y la clasificación de una sola célula deben evalu.......
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Discusión
CUT&RUN es un protocolo eficaz para determinar la localización de proteínas en la cromatina. Tiene muchas ventajas en relación con otros protocolos, que incluyen: 1) alta relación señal-ruido, 2) protocolo rápido y 3) baja cobertura de lectura de secuenciación requerida, lo que lleva a ahorros de costos. El uso de proteína A o proteína A/G-MNasa permite aplicar CUT&RUN con cualquier anticuerpo disponible; por lo tanto, tiene el potencial de perfilar rápida y fácilmente muchas proteínas. Sin embargo, la adaptación a una s.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos relacionados con este proyecto.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Hainer por leer y comentar una versión anterior de este manuscrito. Este proyecto utilizó el NextSeq500 disponible en el Núcleo de Secuenciación de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pittsburgh en el Hospital Pediátrico UPMC de Pittsburgh para la secuenciación con un agradecimiento especial a su director, William MacDonald. Esta investigación fue apoyada en parte por el Centro de Computación de Investigación de la Universidad de Pittsburgh a través de los recursos informáticos proporcionados. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvención R35GM133732 de los Institutos Nacionales de Salud (a S.J.H.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mL | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| Tubo de 1,5 mL gradilla magnética | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| Centrífuga fría compatible con tubo de 1,5 mL | Eppendorf 5404000537 | ||
| placas de cultivo de tejidos estériles de 10 cm | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 Tampón de ADN Ligasa | Nuevo Inglaterra Biolabs | B0202S | |
| 15 mL VWR | 89039-656 | ||
| 1X Tampón TE | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µ L Tubos de PCR | Eppendorf | 951010022 | |
| tampón de ligasa rápida 2X | Tampón de ligasa | M2200 | New England Biolabs |
| 5X TAMPÓN KAPA HiFi | de Roche | 7958889001 | 5X tampón de PCR de alta fidelidad |
| 7-amino-actinomicina D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| rack magnético de 96 pocillos | ThermoFisher Scientific | 12027 o 12331D | |
| placa de 96 pocillos | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP perlas | Beckman Coulter | A63881 | de poliestireno-magnetita; Debido a la posible variabilidad entre los lotes de cuentas AMPure XP, se recomienda calibrar su solución de cuentas AMPure. Ver fabricante' s instrucciones Anticuerpo |
| a la proteína de interés | varía ATP | ||
| ThermoFisher Scientific | R0441 | ||
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugado microesferas paramagnéticas |
| BSA | |||
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Clasificador de células | BD FACSAria II clasificador | Requiere formación | |
| Medios específicos de células para el cultivo celular | Varía | ||
| Cloroformo | ThermoFisher Scientific | C298-500 | El cloroformo es irritante de la piel y dañino si se ingiere; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas |
| protectoras Computadora con procesador de 64 bits y acceso a un clúster | Para análisis computacionales de conjuntos de datos de secuenciación resultantes | ||
| Columnas de espín de ADN | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| El equipo de electroforesis | varía Etanol | ||
| Fisher Scientific | 22032601 | El etanol al 100% vol/vol es altamente inflamable; mango en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio, y gafas | |
| de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glucógeno | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterólogo S. cerevisiae Espiga de ADN en | casa | Preparado a partir de ADN genómico extraído en gel de agarosa y reticulado, digerido por MNasa y purificado de proteína/ARN y diluido a 10 ng/mL. Recomendamos el ADN genómico de la levadura, pero se pueden utilizar otros organismos si es necesario. | |
| Ácido clorhídrico (HCl) | El | A144-212 | Fisher Scientific es muy corrosivo; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas |
| protectoras El cubo de hielo | varía | ||
| de secuenciación Illumina (p. ej., NextSeq500) | Incubadora Illumina | ||
| con control de temperatura y atmósfera | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi ADN polimerasa con 5X TAMPÓN KAPA HiFi | Roche | 7958889001 | hotstart polimerasa de alta fidelidad |
| Campana de flujo laminar Bakery | Company | SG404 | |
| Cloruro de manganeso (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Juego de micropipetas | Rainin | ||
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Adaptador NEB | Adaptador de E6612AVIAL de New England Biolabs | ||
| Imprimación universal NEB Imprimación | E6611AVIAL | New England Biolabs | |
| Oligonucleótidos multiplex NEBNext para kit Illumina | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Imprimadores indexados |
| Anticuerpo de control negativo | Anticuerpos-ABIN101961 | ||
| en líneaAgua libre de nucleasas | New England Biolabs | B1500S | |
| Termociclador PCR | Eppendorf | 2231000666 | |
| Tubos de bloqueo de fase | Qiagen | 129046 | |
| fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | El fenol es dañino si se ingiere o entra en contacto con la piel; manéjelo en una capucha de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas protectoras |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Ayuda para pipetas | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polietilenglicol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | PRECAUCIÓN El KOH es un irritante para los ojos y la piel como solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas |
| protectoras Inhibidores de la proteasa | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNasa |
| ProteinA-MNasa, purificada a partir de pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinasa K | Kit | ||
| Qubit 1X dsDNA HS | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Tubos de ensayo Qubit | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase con tampón 2X Quick Ligase | England Biolabs | M2200S | |
| RNasa A | England Biolabs | T3010 | |
| Acetato de sodio (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS es venenoso si se inhala; manéjelo con cuidado en espacios bien ventilados con guantes, protección para los ojos y un respirador de grado N95 cuando manipule |
| hidróxido de sodio (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | El NaOH es un irritante para los ojos y la piel como una solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas |
| Espermidina | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Microscopio de luz invertida estándar | Leica 11526213 | ||
| Materiales estándar de gel de agarosa de laboratorio | Varía Los materiales de | ||
| laboratorio estándar, como las pipetas serológicas y las puntas de pipeta | Varía T4 | ||
| ADN ligasa | Nuevo Inglaterra Biolabs | M0202S | |
| T4 ADN polimerasa | England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Vórtice de sobremesa | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq ADN polimerasa | England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | alternativamente, puede usar un baño de agua |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 es peligroso; use una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule |
| tripsina | Fisher Scientific | ||
| Rotador de tubos Enzima | VWR | ||
| USER | New England Biolabs | M5505S |
Referencias
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A.
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Reimpresiones y permisos
