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Artículo de método

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

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DOI:

10.3791/63536

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1 de febrero de 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

En este artículo

Resumen

CUT&RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&RUN unicelular.

Resumen

Determinar las ubicaciones de unión de una proteína en la cromatina es esencial para comprender su función y los posibles objetivos reguladores. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para determinar la localización de proteínas durante más de 30 años y se define por el uso de un anticuerpo para extraer la proteína de interés de la cromatina sonicada o digerida enzimáticamente. Más recientemente, las técnicas de anclaje de anticuerpos se han vuelto populares para evaluar la localización de proteínas en la cromatina debido a su mayor sensibilidad. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) es el derivado de todo el genoma del inmunoaprestigio de cromatina (ChIC) y utiliza la proteína A recombinante unida a la nucleasa microcócica (pA-MNasa) para identificar la región constante IgG del anticuerpo dirigida a una proteína de interés, lo que permite la escisión específica del sitio del ADN que flanquea la proteína de interés. CUT&RUN se puede utilizar para perfilar modificaciones de histonas, factores de transcripción y otras proteínas de unión a la cromatina, como los factores de remodelación de nucleosomas. Es importante destacar que CUT&RUN se puede utilizar para evaluar la localización de proteínas asociadas eucromáticas o heterocromáticas y modificaciones de histonas. Por estas razones, CUT&RUN es un método potente para determinar los perfiles de unión de una amplia gama de proteínas. Recientemente, CUT&RUN ha sido optimizado para el perfil del factor de transcripción en poblaciones bajas de células y células individuales y el protocolo optimizado se ha denominado CUT&RUN de entrada ultra baja (uliCUT&RUN). Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de factor de una sola celda utilizando uliCUT& RUN en un formato manual de 96 pocillos.

Introducción

Muchas proteínas nucleares funcionan interactuando con la cromatina para promover o prevenir actividades basadas en plantillas de ADN. Para determinar la función de estas proteínas que interactúan con la cromatina, es importante identificar las ubicaciones genómicas en las que se unen estas proteínas. Desde su desarrollo en 1985, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para identificar dónde se une una proteína a la cromatina 1,2. La técnica chIP tradicional tiene el siguiente flujo de trabajo básico: las células se cosechan y se reticulan (generalmente con formaldehído), la cromatina se corta (generalmente con métodos de sonicación severos, lo que requiere reticulación), la proteína de interés se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo que se dirige a la proteína (o proteína marcada) seguido de un anticuerpo secundario (acoplado a agarosa o perlas magnéticas), la reticulación se invierte, la proteína y el ARN se digieren para purificar el ADN, y este ADN enriquecido con ChIP se utiliza como plantilla para el análisis (utilizando sondas radiomarcadas 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 o secuenciación4). Con el advenimiento de los microarrays y la secuenciación profunda masivamente paralela, ChIP-chip 5,6 y ChIP-seq4 se han desarrollado más recientemente y permiten la identificación de todo el genoma de la localización de proteínas en la cromatina. La reticulación ChIP ha sido una técnica potente y fiable desde su advenimiento con importantes avances en resolución por ChIP-exo7 y ChIP-nexus8. En paralelo al desarrollo de ChIP-seq, se han establecido protocolos nativos (no reticulación) para ChIP (N-ChIP), que utilizan la digestión de nucleasas (a menudo utilizando nucleasa microcócica o MNasa) para fragmentar la cromatina, a diferencia de la sonicación realizada en las técnicas tradicionales de ChIP de reticulación9. Sin embargo, un inconveniente importante de las tecnologías de reticulación ChIP y N-ChIP ha sido el requisito de un alto número de células debido al bajo rendimiento de ADN después de la manipulación experimental. Por lo tanto, en años más recientes, muchos esfuerzos se han centrado en optimizar las tecnologías ChIP para la entrada de células bajas. Estos esfuerzos han dado lugar al desarrollo de muchas tecnologías poderosas basadas en ChIP que varían en su aplicabilidad y requisitos de insumos 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Sin embargo, han faltado tecnologías basadas en ChIP-seq de una sola célula, especialmente para las proteínas no histonas.

En 2004, se desarrolló una tecnología alternativa para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina denominada Escisión Endógena de Cromatina (ChEC) e Inmunoapalamento de Cromatina (ChIC)19. Estas técnicas de locus único utilizan una fusión de MNasa a la proteína de interés (ChEC) o a la proteína A (ChIC) para el corte directo del ADN adyacente a la proteína de interés. En años más recientes, tanto ChEC como ChIC se han optimizado para el perfil de proteínas de todo el genoma en la cromatina (ChEC-seq y CUT&RUN, respectivamente)20,21. Si bien ChEC-seq es una técnica poderosa para determinar la localización de factores, requiere el desarrollo de proteínas de fusión de MNasa para cada objetivo, mientras que ChIC y su variación de todo el genoma, CUT&RUN, se basan en un anticuerpo dirigido hacia la proteína de interés (como con ChIP) y la proteína A-MNasa recombinante, donde la proteína A puede reconocer la región constante IgG del anticuerpo. Como alternativa, se ha desarrollado una fusión proteína A/proteína G-MNasa (pA/G-MNasa) que puede reconocer una gama más amplia de regiones constantes de anticuerpos22. CUT&RUN se ha convertido rápidamente en una alternativa popular a ChIP-seq para determinar la localización de proteínas en todo el genoma de la cromatina.

La entrada ultrabaja CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variación de CUT&RUN que permite el uso de entradas bajas y de una sola celda, se describió en 201923. Aquí, se describe la metodología para una aplicación manual de una sola celda en formato de 96 pocillos. Es importante destacar que desde el desarrollo de uliCUT&RUN, se han desarrollado dos alternativas para el perfilado de histonas, CUT&Tag e iACT-seq, proporcionando perfiles robustos y altamente paralelos de proteínas histonas24,25. Además, scCUT&Tag ha sido optimizado para perfilar múltiples factores en una sola célula (multiCUT&Tag) y para su aplicación a proteínas no histonas26. Juntos, CUT&RUN proporciona una alternativa atractiva a ChIP-seq de baja entrada donde uliCUT&RUN se puede realizar en cualquier laboratorio de biología molecular que tenga acceso a un clasificador celular y equipo estándar.

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Protocolo

Declaración de ética: Todos los estudios fueron aprobados por la Oficina Institucional de Bioseguridad de Protecciones de Investigación de la Universidad de Pittsburgh.

1. Prepara cuentas magnéticas

NOTA: Realice antes de la clasificación de celdas y mantenga el hielo hasta su uso.

  1. Pipetear 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA mezcla de lodo de perlas por reacción a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml y agregar 850 μL de binding buffer, pipeteando suavemente para mezclar.
    NOTA: Las microesferas paramagnéticas conjugadas con A son perlas magnéticas recubiertas de lectina que permiten la unión a la membrana lipídica.
  2. Coloque el tubo en una rejilla magnética y permita que las perlas se imanten durante 1-2 minutos. Una vez que el sobrenadante se haya despejado, retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.
  3. Retire el tubo de la rejilla magnética y lave las perlas resuspiendo en 1 ml de binding buffer.
  4. Repita los pasos 1.2 y 1.3.
  5. Magnetizar las perlas durante 2 min y retirar el sobrenadante para desecharlo.
  6. Retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en 30 μL de binding buffer por reacción.
  7. Sostenga la mezcla de cuentas lavadas sobre hielo hasta que se clasifiquen las células.

2. Células de cosecha

NOTA: Este paso está escrito para células adheridas y optimizado para células madre embrionarias murinas E14. El cultivo y la cosecha de las células dependen del tipo de célula.

  1. Retire las células de la incubadora de 37 °C y examínelas bajo un microscopio para asegurar la calidad.
  2. Aspire el medio de la placa celular y enjuague con 5 ml de 1x PBS.
  3. Aspire PBS de la placa y recolecte las células (utilizando métodos tradicionales de recolección de células que diferirán según el tipo de célula). Obtenga la suspensión unicelular canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica contra el plato de cultivo, si es necesario.
  4. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min.
  5. Aspirar fuera del medio para desechar y lavar el pellet celular con 5 mL de PBS + 1% FBS.
  6. Gire hacia abajo las células a 200 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de PBS + 1% FBS.
  7. Cuente las células y transfiera 1 ml de 1 x 106 células a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml.
  8. Agregue 5 μL de 7-amino-actinomicina D (7-AAD), invierta el tubo bien para mezclar y luego aplique la muestra al clasificador celular para clasificar células individuales vivas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.
    NOTA: El colorante 7-AAD está excluido de las células vivas y, por lo tanto, se puede utilizar en la clasificación de células vivas.

3. Clasificación celular y lisis

  1. Prepare una placa de 96 pocillos compatible con el clasificador de celdas con 100 μL de tampón de extracción nuclear (NE) en cada pozo antes de la clasificación de celdas.
  2. Clasifique las celdas en placas de 96 pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Haga girar rápidamente la placa (600 x g durante 30 s) para asegurarse de que las células estén en el tampón dentro de los pozos.
    NOTA: Vale la pena probar en un experimento preliminar si las células que se utilizan se llevan de manera confiable al fondo de los pozos.
  4. Mantenga las muestras en hielo durante 15 minutos.
  5. Gire las muestras a 600 x g durante 5 min a 4 °C y pipetee cuidadosamente para eliminar el sobrenadante (dejando atrás 5 μL).
  6. Resuspender cada muestra en 55 μL de tampón NE y añadir 30 μL de las microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA prelavadas (a partir del paso 1.7; en Binding Buffer) a cada reacción.
  7. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.

4. Muestras prebloqueadas para prevenir la digestión temprana por MNasa

  1. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, permita que las perlas se unan durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante.
  2. Agregue 100 μL de buffer de bloqueo a las perlas unidas al núcleo y mezcle con pipeteo suave.
  3. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.

5. Adición de anticuerpos primarios

  1. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
  2. Retire la placa de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en 100 μL de wash buffer por reacción con un pipeteo suave.
  3. Vuelva a colocar la placa en el bastidor magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje y luego retire y deseche el sobrenadante.
  4. Resuspend las perlas en 25 μL de Wash Buffer por reacción con pipeteo suave.
  5. Haga una mezcla maestra de anticuerpos primarios: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticuerpo por reacción.
  6. Mientras vórtice suavemente las perlas unidas a los núcleos, agregue 25 μL de la mezcla maestra de anticuerpos primarios a cada muestra que se esté tratando con un anticuerpo dirigido a la proteína de interés (típicamente dilución final 1:100). Añadir 25 μL de Wash Buffer sin anticuerpos, si se realiza un control.
  7. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  8. Coloque las muestras en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
  9. Retire la placa de la rejilla magnética y lave las perlas con 100 μL de Wash Buffer, resuspiendo por pipeteo.

6. Adición de pA-MNasa o pA/G-MNasa

NOTA: La proteína A tiene una alta afinidad por las moléculas de IgG de ciertas especies, como los conejos, pero no es adecuada para las IgG de otras especies, como ratones o ratas. Alternativamente, se puede utilizar la proteína A /G-MNasa. Este híbrido se une a igG de conejo, ratón y rata, evitando la necesidad de anticuerpos secundarios cuando se utilizan anticuerpos primarios de ratón o rata.

  1. Coloque la placa de nuevo en un estante magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
  2. Retire la placa de la rejilla magnética y vuelva a suspender cada muestra en 25 μL de wash buffer.
  3. Haga una mezcla maestra de pA-MNasa (25 μL de Wash Buffer + cantidad optimizada de pA-MNasa por reacción).
  4. Mientras vórtice suavemente, agregue 25 μL de la mezcla maestra pA-MNasa a cada muestra, incluidas las muestras de control.
    NOTA: La concentración de pA-MNasa varía según la preparación, si es casera, y debe probarse antes de su uso en cada purificación independiente. Para la pA/G-MNasa, se deben utilizar 2,5 μL de la culata 20x.
  5. Incubar las muestras durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
  7. Retire la placa de la rejilla magnética y lave las perlas con 100 μL de Wash Buffer, resuspiendo mediante pipeteo suave.

7. Digestión dirigida del ADN

  1. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante.
  2. Retire las muestras del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 50 μL de Wash Buffer mediante pipeteo suave.
  3. Equilibre las muestras a 0 °C en una mezcla de hielo y agua durante 5 min.
  4. Retire las muestras del baño de hielo/agua a 0 °C y agregue 1 μL de CaCl2 de 100 mM utilizando una pipeta multicanal. Mezcle bien (3-5 veces) con pipeteo suave utilizando una pipeta multicanal de mayor volumen, y luego devuelva las muestras a 0 ° C.
    NOTA: Mezclar bien aquí es esencial. Se añade CaCl2 para activar la digestión de la MNasa del ADN que flanquea la proteína de interés.
  5. Inicie un temporizador de 10 minutos tan pronto como la placa vuelva al baño de hielo / agua.
  6. Detenga la reacción canalizando 50 μL de 2XRSTOP+ Buffer en cada pozo, en el mismo orden en que se agregó el CaCl2 .
    NOTA: Haga 2XRSTOP + Buffer antes de que termine la digestión de 10 minutos para evitar la digestión excesiva.

8. Fraccionamiento de muestras

  1. Incubar las muestras durante 20 min a 37 °C.
  2. Girar la placa a 16.000 x g durante 5 min a 4 °C.
  3. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y transfiera los sobrenadantes a una placa fresca de 96 pocillos. Descarta las cuentas.

9. Extracción de ADN

  1. Añadir 1 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS) y 0,83 μL de 20 mg/ml de proteinasa K a cada muestra.
    PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es dañino si se inhala. Los usuarios deben usar en espacios bien ventilados usando gafas, guantes y un respirador de grado N95, manejando con cuidado.
  2. Mezclar las muestras mediante pipeteo suave.
  3. Incubar las muestras durante 10 min a 70 °C.
  4. Devolver la placa a temperatura ambiente y añadir 46,6 μL de 5 M de NaCl y 90 μL de 50% de PEG 4000. Mezclar mediante pipeteo suave.
  5. Añadir 33 μL de perlas de poliestireno-magnetita a cada muestra e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Asegúrese de llevar las perlas de poliestireno-magnetita a temperatura ambiente (~ 30 min) y mezcle bien antes de usar.
  6. Coloque la placa en un estante magnético y deje que el sobrenadante se despeje durante ~ 5 minutos, y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las cuentas.
  7. Enjuague 2x con 150 μL de etanol al 80% sin molestar las perlas.
    PRECAUCIÓN: El etanol es altamente inflamable y causa irritación de la piel, los ojos y los pulmones. Realice este paso con la ropa de laboratorio adecuada y en una capucha ventilada.
  8. Gire la placa brevemente a 1000 x g durante 30 s. Vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y retire todo el EtOH residual sin molestar las perlas.
  9. Seque al aire las muestras durante ~ 2-5 min.
    NOTA: No seque las perlas por más de 5 minutos. Si es diligente en la eliminación del EtOH, 2-3 minutos de secado son suficientes.
  10. Resuspendir las perlas con 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  11. Coloque la placa en un estante magnético y deje que las cuentas se unan durante 5 minutos.
  12. Transfiera 36,5 μL del sobrenadante a una placa de 96 pocillos compatible con termociclador fresco. Descarta las cuentas.
    NOTA: El experimento se puede detener aquí almacenando muestras a -20 °C o puede continuar con la compilación de la biblioteca (pasos 10-15).

10. Reparación final, fosforilación, adenilación

NOTA: Los reactivos se obtienen como se hace referencia en la Tabla de Materiales. El siguiente protocolo sigue un método similar al kit comercial como el kit NEBNext Ultra DNA II.

  1. Diluir 5 U/μL de ADN polimerasa T4 1:20 en 1 tampón de ADN ligasa T4.
  2. Preparar una mezcla maestra de reparación final/3'A: 2 μL de tampón de la ligasa de ADN T4 10x, 2,5 μL de dNTP de 10 mM, 1,25 μL de ATP de 10 mM, 3,13 μL de PEG 4000 al 40%, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de ADN polimerasa T4 diluida, 0,5 μL de ADN polimerasa Taq 5U/μL, con un volumen total de 13,5 μL por reacción.
    NOTA: Asegúrese de llevar el 40% de PEG 4000 a temperatura ambiente antes de pipetear.
  3. Añadir 13,5 μL de mezcla maestra de reparación final/3'A a 36,5 μL de ADN.
  4. Mezcle la reacción por vórtice rápido y luego un giro rápido (500 x g durante 10 s).
  5. Incubar utilizando las siguientes condiciones de reacción en un termociclador preenfriado con una tapa calentada para temperaturas >20 °C. Utilice las condiciones de reacción: 12 °C durante 15 min, 37 °C durante 15 min, 72 °C durante 20 min, mantener a 4 °C.

11. Ligadura del adaptador

NOTA: Mantenga las muestras en hielo mientras configura la siguiente reacción. Permita que el tampón de ligasa llegue a temperatura ambiente antes de pipetear. Diluir el adaptador (ver Tabla de Materiales) en una solución de 10 mM Tris-HCl que contenga 10 mM NaCl (pH 7.5). Debido al bajo rendimiento, no precuantifique el ADN enriquecido con CUT&RUN. Más bien, genere diluciones de 25 veces del adaptador, utilizando una concentración final del adaptador de trabajo de 0,6 μM.

  1. Haga una mezcla maestra de ligadura: 55 μL de tampón de ligasa (2x), 5 μL de ADN ligasa T4 y 5 μL de adaptador diluido, con un volumen total de 65 μL por reacción.
  2. Añadir 65 μL de la mezcla de ligadura maestra a 50 μL de ADN a partir del paso 10.5.
  3. Mezclar por vórtice rápido, seguido de hilado rápido (500 x g durante 10 s).
  4. Incubar a 20 °C en un termociclador (sin tapa calefactada) durante 15 min.
    NOTA: Continúe inmediatamente con el siguiente paso.

12. Digestión del USUARIO

  1. Agregue 3 μL de enzima USER a cada muestra, vórtice y espín (500 x g durante 10 s).
  2. Incubar en termociclador a 37 °C durante 15 min (tapa calentada a 50 °C).

13. Limpieza de perlas de poliestireno-magnetita después de la reacción de ligadura

NOTA: Permita que las perlas de poliestireno-magnetita se equilibren a temperatura ambiente (~ 30 min). Vórtice para homogeneizar la solución de perlas antes de usarla. Realice los siguientes pasos a temperatura ambiente.

  1. Añadir 39 μL (0,33x) de solución de perlas de poliestireno-magnetita a cada pocillo que contenga ADN ligado por adaptador.
  2. Mezcle bien mediante pipeteo y luego incube las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
  3. Coloque las muestras en un estante magnético de 96 pocillos e incube durante 5 minutos hasta que el sobrenadante esté despejado.
  4. Mantenga la placa en la rejilla magnética y retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las perlas.
  5. Enjuague las perlas con 200 μL de 80% etOH sin molestar las perlas.
  6. Incubar durante 30 s en un bastidor magnético de 96 pocillos para permitir que la solución se despeje.
  7. Retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.
  8. Repita los pasos 13.5-13.7 para un total de dos lavados.
  9. Gire la placa brevemente a 500 x g durante 10 s, vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y elimine el EtOH residual sin molestar las perlas.
  10. Mantenga la placa en el estante magnético y seque al aire las muestras durante 2 minutos.
    NOTA: No seque en exceso las cuentas.
  11. Retire la placa del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es muy corrosivo. Los usuarios deben manejarlo con cuidado en una capucha de humo químico usando gafas, guantes y una bata de laboratorio.
  12. Resuspenda completamente las cuentas mediante pipeteo, teniendo cuidado de no producir burbujas.
  13. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  14. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deje que la solución se despeje durante 5 minutos.
  15. Transfiera 27,5 μL de sobrenadante a una nueva placa de PCR y deseche las perlas.

14. Enriquecimiento de la biblioteca

NOTA: Los cebadores se diluyen con la misma solución que el adaptador. Para esta construcción de biblioteca, utilice una concentración final de imprimación de trabajo de 0,6 μM.

  1. Añadir 5 μL de imprimación indexada diluida (ver Tabla de Materiales) a cada muestra.
    NOTA: Cada muestra necesita un índice diferente para ser identificado después de la secuenciación.
  2. Preparar una mezcla maestra de PCR: 10 μL de tampón de PCR de alta fidelidad 5x, 1,5 μL de dNTP de 10 mM, 5 μL de imprimación universal diluida, 1 μL de polimerasa de alta fidelidad de inicio en caliente de 1 U, con un volumen total de mezcla maestra de 17,5 μL por muestra.
  3. Añadir 17,5 μL pf mezcla de PCR a 32,5 μL de ADN ligado por adaptador purificado (en este volumen se incluyen 5 μL de imprimación indexada).
  4. Mezclar la solución mediante pipeteo.
  5. Incubar en un termociclador utilizando las siguientes condiciones de reacción con una velocidad de rampa máxima de 3 °C/s: 98 °C durante 45 s, 98 °C durante 45 s, 60 °C durante 10 s, repetir el segundo y tercer paso 21 veces, 72 °C durante 1 min, mantener a 4 °C.
    NOTA: Las muestras se pueden mantener a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o -20 °C para almacenamiento a largo plazo.

15. Limpieza de cuentas de poliestireno-magnetita

  1. Añadir 60 μL (1,2x) de perlas de poliestireno-magnetita a cada muestra.
  2. Resuspend las perlas mediante pipeteo e incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Coloque la placa en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara.
  4. Deseche el sobrenadante y enjuague las perlas con 200 μL de 80% etOH sin molestar las perlas.
  5. Repita el paso de lavado para un total de dos lavados al 80% de EtOH.
  6. Gire la placa a 500 x g durante 10 s, coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y permita que las cuentas se unan durante 5 minutos.
  7. Pipeta para eliminar el exceso de EtOH sin molestar las perlas y dejar que las perlas se sequen al aire durante 2 min.
    NOTA: No seque en exceso las cuentas.
  8. Resuspend las perlas en 21 μL de agua libre de nucleasa e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  9. Coloque la placa en un estante magnético y deje que la solución se despeje durante 5 minutos.
  10. Transfiera 20 μL del sobrenadante a una nueva placa.
    NOTA: El experimento se puede detener aquí almacenando la muestra a -20 °C.
  11. Cuantificar las concentraciones de la biblioteca con un fluorómetro (ver Tabla de Materiales), utilizando un reactivo 1x HS.
  12. Si la concentración lo permite, ejecute 30 ng de muestra en gel de agarosa al 1,5% con una escalera de bajo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualice en un analizador de fragmentos o instrumento relacionado.
  13. Bibliotecas de secuencias en una plataforma Illumina para obtener ~50,000-100,000 lecturas mapeadas de forma única.

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Resultados

Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de proteínas unicelulares en cromatina utilizando un formato manual de 96 pocillos uliCUT&RUN. Si bien los resultados variarán según la proteína que se perfila (debido a la abundancia de proteínas y la calidad de los anticuerpos), el tipo de célula y otros factores contribuyentes, los resultados anticipados para esta técnica se discuten aquí. La calidad celular (apariencia celular y porcentaje de células viables) y la clasificación de una sola célula deben evalu...

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Discusión

CUT&RUN es un protocolo eficaz para determinar la localización de proteínas en la cromatina. Tiene muchas ventajas en relación con otros protocolos, que incluyen: 1) alta relación señal-ruido, 2) protocolo rápido y 3) baja cobertura de lectura de secuenciación requerida, lo que lleva a ahorros de costos. El uso de proteína A o proteína A/G-MNasa permite aplicar CUT&RUN con cualquier anticuerpo disponible; por lo tanto, tiene el potencial de perfilar rápida y fácilmente muchas proteínas. Sin embargo, la adaptación a una s...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos relacionados con este proyecto.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del Laboratorio Hainer por leer y comentar una versión anterior de este manuscrito. Este proyecto utilizó el NextSeq500 disponible en el Núcleo de Secuenciación de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pittsburgh en el Hospital Pediátrico UPMC de Pittsburgh para la secuenciación con un agradecimiento especial a su director, William MacDonald. Esta investigación fue apoyada en parte por el Centro de Computación de Investigación de la Universidad de Pittsburgh a través de los recursos informáticos proporcionados. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvención R35GM133732 de los Institutos Nacionales de Salud (a S.J.H.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microfuga transparentes de 1,5 mLThermoFisher Scientific90410
Tubo de 1,5 mL gradilla magnéticaThermoFisher Scientific12321D
Centrífuga fría compatible con tubo de 1,5 mLEppendorf 5404000537
placas de cultivo de tejidos estériles de 10 cmThermoFisher Scientific150464
10X T4 Tampón de ADN LigasaNuevo Inglaterra BiolabsB0202S
15 mL VWR89039-656
1X Tampón TEThermoFisher Scientific12090015
200 µ L Tubos de PCREppendorf951010022
tampón de ligasa rápida 2XTampón de ligasaM2200New England Biolabs
5X TAMPÓN KAPA HiFide Roche79588890015X tampón de PCR de alta fidelidad
7-amino-actinomicina D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
rack magnético de 96 pocillosThermoFisher Scientific12027 o 12331D
placa de 96 pocillosVWR82006-636
AMPure XP perlasBeckman CoulterA63881de poliestireno-magnetita; Debido a la posible variabilidad entre los lotes de cuentas AMPure XP, se recomienda calibrar su solución de cuentas AMPure. Ver fabricante' s instrucciones Anticuerpo
a la proteína de interésvaría ATP
ThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A beadsPolysciences86057-10ConA-conjugado microesferas paramagnéticas
BSA
Cloruro de calcio (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Clasificador de célulasBD FACSAria II clasificadorRequiere formación
Medios específicos de células para el cultivo celularVaría
CloroformoThermoFisher ScientificC298-500El cloroformo es irritante de la piel y dañino si se ingiere; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas
protectoras Computadora con procesador de 64 bits y acceso a un clústerPara análisis computacionales de conjuntos de datos de secuenciación resultantes
Columnas de espín de ADNEpoch Life Sciences1920-250
dNTP setNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
El equipo de electroforesisvaría Etanol
Fisher Scientific22032601El etanol al 100% vol/vol es altamente inflamable; mango en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio, y gafas
de ácido etilendiaminotetraacético  (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlucógenoVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Heterólogo S. cerevisiae Espiga de ADN encasaPreparado a partir de ADN genómico extraído en gel de agarosa y reticulado, digerido por MNasa y purificado de proteína/ARN y diluido a 10 ng/mL. Recomendamos el ADN genómico de la levadura, pero se pueden utilizar otros organismos si es necesario.
Ácido clorhídrico  (HCl)ElA144-212Fisher Scientific es muy corrosivo; manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas
protectoras El cubo de hielovaría
de secuenciación Illumina (p. ej., NextSeq500)Incubadora Illumina
con control de temperatura y atmósferaThermoFisher Scientific51030284
KAPA HotStart HiFi ADN polimerasa con 5X TAMPÓN KAPA HiFiRoche7958889001hotstart polimerasa de alta fidelidad
Campana de flujo laminar BakeryCompanySG404
Cloruro de manganeso (MnCl2)Sigma Aldrich244589
Juego de micropipetasRainin
MinifugeBenchmark ScientificC1012
Adaptador NEBAdaptador de E6612AVIAL de New England Biolabs
Imprimación universal NEB ImprimaciónE6611AVIALNew England Biolabs
Oligonucleótidos multiplex NEBNext para kit IlluminaNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LImprimadores indexados
Anticuerpo de control negativoAnticuerpos-ABIN101961
en líneaAgua libre de nucleasasNew England BiolabsB1500S
Termociclador PCREppendorf2231000666
Tubos de bloqueo de faseQiagen129046
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI)ThermoFisher Scientific15593049El fenol es dañino si se ingiere o entra en contacto con la piel; manéjelo en una capucha de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas protectoras
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
Ayuda para pipetasDrummond Scientific# 4-000-100
Polietilenglicol (PEG) 4000VWRA16151
Cloruro de potasio (KCl)Sigma AldrichP3911
Hidróxido de potasio (KOH)Fisher ScientificP250-1PRECAUCIÓN El KOH es un irritante para los ojos y la piel como solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas
protectoras Inhibidores de la proteasaThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNasa
ProteinA-MNasa, purificada a partir de pK19pA-MNAddgene86973
Proteinasa KKit
Qubit 1X dsDNA HSThermoFisher ScientificQ33230
Tubos de ensayo QubitThermoFisher ScientificQ32856
QubitThermoFisher ScientificQ33238
Quick Ligase con tampón 2X Quick LigaseEngland BiolabsM2200S
RNasa AEngland BiolabsT3010
Acetato de sodio  (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Dodecil sulfato de sodio (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS es venenoso si se inhala; manéjelo con cuidado en espacios bien ventilados con guantes, protección para los ojos y un respirador de grado N95 cuando manipule
hidróxido de sodio (NaOH)Fisher ScientificS318-1El NaOH es un irritante para los ojos y la piel como una solución sólida y corrosiva. Manéjelo en una campana de gases químicos con guantes, una bata de laboratorio y gafas
EspermidinaSigma AldrichS2626
Microscopio de luz invertida estándarLeica 11526213
Materiales estándar de gel de agarosa de laboratorioVaría Los materiales de
laboratorio estándar, como las pipetas serológicas y las puntas de pipetaVaría T4
ADN ligasaNuevo Inglaterra BiolabsM0202S
T4 ADN polimerasaEngland BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Vórtice de sobremesaFisher Scientific2215414
Taq ADN polimerasaEngland BiolabsM0273S
ThermomixerEppendorf5384000020alternativamente, puede usar un baño de agua
Tris baseFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 es peligroso; use una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule
tripsinaFisher Scientific
Rotador de tubos EnzimaVWR
USERNew England BiolabsM5505S
Tubos cónicos de de Tampón de ligasa de células de supercomputación ácido clorhídrico de Plataforma 30386597 universal de de ensayo New England Biolabs P8107S New New , New New MT25052 10136084

Referencias

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