Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie

La actividad antiviral asociada a la teterina es inducida por el interferón-α, y comprende ataduras basadas en proteínas, que conducen a la retención de viriones completamente formados en las superficies celulares infectadas¹. La necesidad de glicosilación de la teterina en la inhibición de la liberación del virus sigue siendo incierta, lo que implica la importancia de los patrones de glicosilación en los glicanos expresados recombinantemente para los estudios in vitro ^1,2, que depende de la conformación de (en el caso del virus de la gripe) hemaglutinina HA ^3,4 de la gripe expresada en superficie (en el caso del virus de la gripe) . Se ha observado que la modificación del oligosacárido atado a la glicosilación ligada a N es suficiente para la restricción mediada por la teterina de la liberación 2 del VIH tipo 1, mientras que la dimerización desempeña un papel esencial en la prevención de^{la liberación del} virus, involucrando así el dominio transmembrana o el anclaje glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para atar los viriones en ciernes⁵ . Se describen características únicas para la teterina humana y murina para bloquear múltiples virus, retrovirus y filovirus envueltos. BST-2/teterina es una proteína antiviral inducible por interferón de la inmunidad innata^1,6, que actúa con actividad antiviral de amplio espectro y es antagonizada por las glicoproteínas de la envoltura 5 para translocar la teterina o alterar la estructura^de la teterina ⁶. Por ejemplo, la glicoproteína HA de la envoltura expresada en superficie y la neuraminidasa en el virus de la influenza A son bien conocidas por el antagonismo de la teterina de una manera específica de la cepa⁷, lo que facilita el reconocimiento de los sitios de unión al receptor del huésped⁸. Los anticuerpos dirigidos a glicanos se estudian en la estequiometría de sus interacciones con los escudos de glicanos que se personalizan rápidamente en HA, lo que resulta en una afinidad de unión a los subtipos⁴ de influenza A H3N2 y H1N1.

Para dilucidar los mecanismos de unión entre los agentes antivirales y los picos de envoltura del virus, es decir, ligandos de carbohidratos y métodos inmunológicos y espectroscópicos complementarios, se sintetizan químicamente restos mono, di- y trimanosa. Los péptidos manosilados se crean a través de la glicosilación azido de glicosil {beta}-peracetatos a 1,2-trans glicosil azidas transformación⁹, imitando la N-acetil glucosamina y oligosacáridos con alto contenido de manosa en la superficie de virus potencialmente mortales. Los bioisósteres de triazol se utilizan para imitar los enlaces que forman el residuo manosilado del péptido HA¹⁰ y facilitar las interacciones específicas del sitio con derivados antivirales CV-N alrededor del segundo punto de glicosilación ligado a N en el dominio de la cabeza de HA (HA superior con 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Las interacciones entre el ácido glutámico (Glu) y la arginina (Arg) y el dipolo de hélice resultante manifestaron una buena estabilidad tanto de péptidos modelo como de proteínas, pero se visualizan utilizando SPR. Si se compara con el reconocimiento de un único sitio de glicosilación sintetizado químicamente en HA¹⁰ mediante la inhibición directa de la unión del receptor en las fracciones de glicanos, se muestra que una mayor afinidad de una estructura Fc mutada de cuatro sitios a su receptor provoca funciones efectoras in vivo, revelando que la composición no relacionada de glicanos ligados a N unidos al mutante Fc se determina mecánicamente¹³.

CV-N muestra actividad antiviral contra el VIH 14,15, la influenza¹⁶ y el virus del Ébola, que está mediada por la unión nanomolar a modificaciones de oligosacáridos con alto contenido de manosa en las proteínas de espiga de la envoltura^12,17,18,19. Se determina que la unión de HA de influenza a un sitio de unión a carbohidratos (H) de alta afinidad en CV-N o dos Hs en CVN2 dimérica unida covalentemente tiene constantes de disociación de equilibrio (K D) = 5.7 nM (Figura 1A) y K_D = 2.7 nM, respectivamente. Tanto CV-N como CVN2 albergan otros uno o dos sitios de unión a carbohidratos (L) de baja afinidad 12,17,20,21. El ébola GP1,2 se une a 2H de CVN2 con afinidades en el rango nanomolar inferior (K_D = 26 nM). La unión CV-N WT al Ébola GP1,2 y HA exhibe afinidades de K D = 34 nM a K_D = 5.7 nM (A/New York/55/04)¹². Las lectinas, como CV-N, que se dirigen específicamente a los glicanos con alto contenido de manosa en las envolturas virales, inhiben aún más la replicación del virus de la hepatitis C, el SARS-CoV, el herpesvirus, el virus de Marburgo y el virus del sarampión²².

La pequeña molécula CV-N ha sido estudiada a fondo durante más de 20 años, ya que se funcionaliza para unirse a una amplia gama de virus para inhibir la entrada viral^16,18. Los análisis estructurales y los ensayos de afinidad de unión indican la reticulación de dos Ls en un dímero CVN2 intercambiado por dominio mediante unión bivalente en el rango micromolar para mejorar la avidez a las glicoproteínas de la envoltura viral^10,19. La unión selectiva de Manα1-2Manα en los brazos Man(8) D1D3 y Man(9) comprende dos sitios de unión de diferentes afinidades localizadas en protómeros proteicos opuestos²⁰, alcanzando así afinidades de unión nanomolar (Figura 1B). Por lo tanto, CVN2 se considera un pseudo-anticuerpo en cuanto a su aplicación para unirse a epítopos en el gp120 del VIH, similar a los anticuerpos neutralizantes del virus¹⁷. En este documento, el autor está interesado en investigar la posible unión de CVN2 al pico de SARS-CoV-2 a través de su dominio de unión al receptor (RBD). Las curvas de unión de la enzima convertidora de angiotensina humana inmovilizada (ECA)-2 con el RBD del SARS-CoV-2 dan como resultado K_D = 4,7 nM para esta interacción de unión biológicamente relevante²³.

Por el contrario, las clases seleccionadas de inmunoglobulinas reconocen patrones proteicos estructurales específicos y consistentes, que imparten un sustrato para la maduración de la afinidad en las regiones HA ancladas a la membrana²⁴. CV-N muestra una actividad altamente potente en casi todos los virus de la influenza A y B¹⁶, y es un agente antiviral ampliamente neutralizante. Nuestro conocimiento es incompleto sobre la ubicación de epítopos dirigidos en el tallo de HA1 y HA2 que posiblemente involucran estructuras epitópicas para la focalización de glicanos por anticuerpos altamente neutralizantes y en comparación con la unión a lectinas²⁵.

Figura 1: Representación esquemática del ensayo de unión SPR para CV-N a picos de envoltura del virus. (A) Ensayo SPR para la unión de CV-N al ligando: proteína HA de longitud completa (90 kDa). Conjunto de datos cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) que muestran la unión de doble referencia en tiempo real a la influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 que se une al ligando inmovilizado DM dentro de un rango de concentración de 500 nM a 16 μM. Secuencia: Los residuos L se resaltan en amarillo. Los residuos H se resaltan en gris. E58 y R73 son un reemplazo para las cisteínas en la proteína de tipo salvaje y hacen de V2 un pliegue de proteína estable con tres enlaces disulfuro en lugar de cuatro Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mientras que el escudo glicanos en la parte superior de HA distal de membrana induce una unión de alta afinidad a CV-N 12, la unión de CVN2 a HA adyacente a un puente disulfuro de la parte superior de HA se ha observado además en sus sitios de baja afinidad^10,12. Varias interacciones polares y sitios de interacción se identifican en la unión de carbohidratos por CV-N. Estas interacciones se verifican mediante la generación de variantes knock-out en el sitio de unión para correlacionar las afinidades de unión con la glicosilación predicha in silico ¹². Por lo tanto, el proyecto tiene como objetivo comparar péptidos HA químicamente manosilados previamente probados en afinidad y especificidad de unión con secuencias cortas de péptidos de picos de 2019-nCoV relacionados con el SARS y SARS-CoV-2, que ocurren naturalmente modificados por un pequeño número de diferentes sitios de glicosilación ligados a N y glicosilación ligada a O. Usando microscopía crioelectrónica y ensayos de unión, Pinto y sus colaboradores reportan un anticuerpo monoclonal, S309, que potencialmente reconoce un epítopo en la proteína espiga del SARS-CoV-2 que contiene un glicano conservado dentro del subgénero Sarbecovirus, sin competir con la unión al receptor²⁶. El protocolo de este estudio describe cómo el diseño, la expresión y la caracterización de variantes de CV-N son importantes para estudiar cómo CV-N y CVN2 se unen a proteínas glicosiladas y péptidos manosilados sintéticos utilizando la tecnología SPR^10,12.

El dímero ligado en tándem CVN2L0²⁷ y las variantes del sitio de unión (V2-V5) se expresan de forma recombinante y las variantes se expresan con reemplazos de enlaces disulfuro (C58E y C73R) (Figura 2A). Además, se prepara un mutante con una mutación de un solo punto E41A porque esta posición se ha visto como un residuo de contacto cruzado intermolecular. Este mutante es otra molécula interesante para las mediciones de unión SPR entre la lectina y los oligosacáridos con alto contenido de manosa que descifran los dominios de unión y permiten la comparación con la forma dimérica. La estructura cristalina intercambiada de dominio de CVN2 muestra un enlazador flexible, que se extiende entre 49 y 54 residuos. Los dos dominios pueden continuar moviéndose alrededor de la bisagra como cuerpos rígidos, desarrollando un monómero a través de interacciones de dominio intramolecular (dominio A -residuos 1-39;90-101- con dominio B -residuos 40-89) o un dímero por intercambio de dominio intermolecular [dominio A (del primer monómero) con dominio B (del segundo), y dominio B (del primer monómero) con dominio A (de la segunda copia)]. No hay interacciones cercanas entre los dominios A y B de los dos protómeros, excepto para Glu41²⁸. El gen para CV-N puede desarrollarse utilizando un método de PCR repetitivo con oligos²⁹ sintetizados de 40 mer y luego se subclona en los sitios NdeI y BamHI de pET11a para su transformación (electroporación) en células electrocompetentes como lo describe Keeffe, J.R.27. La proteína, que se utiliza para lograr la estructura cristalina respectiva (PDB ID 3S3Y), incluye una etiqueta de purificación de 6-histidina N-terminal seguida de un sitio de escisión de la proteasa del factor Xa. La mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para hacer mutaciones puntuales, cambiar codones e insertar o eliminar bases o codones únicos o múltiples para el intercambio de aminoácidos. Estas transformaciones proporcionan información invaluable sobre la función y estructura de las proteínas. Los CV-N, CVN2 y CVN3 expresados y purificados recombinantemente han sido biofísicamente bien estudiados^20,21,27, son baratos de producir y, por lo tanto^, se utilizan para caracterizar ensayos de unión a glicanos inmovilizados en chips sensores SPR. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas convencional (ELISA) proporciona menos reproducibilidad con respecto a la técnica de inmovilización de ligandos de glicano y transforma la unión en tiempo real de varias variantes del sitio de unión, que se muestra para SPR, en ensayos de punto final.

La variante de afinidad de unión CVN2L0-V2 (un pliegue intacto de CV-N homodimérico con una sustitución de puente disulfuro¹⁰) se expresa con una etiqueta His en Escherichia coli (E. coli), purificada sobre una columna de Ni-NTA aplicando cromatografía de afinidad y probada para unirse a HA (H3N2), péptido HA monomanosilado y péptido HA dimanosilado usando SPR. Los péptidos químicamente manosilados, o proteína HA y S, todos son ligandos y aminas acoplados a la superficie del chip hidrófilo. a través de ésteres reactivos o ingeniería de proteínas biotina-estreptavidina. El mismo procedimiento de corridas secuenciales se aplica a esos ligandos, inyectando diversas diluciones de CV-N y variantes de CV-N (y CVN2) para obtener información cinética para los análisis de interacción molecular como se describe a continuación³⁰. El chip sensor SPR inmovilizado RBD se utiliza para estudios de unión en péptidos CV-N a S, y las afinidades se comparan con la unión del SARS-CoV-2 con el ACE2 humano.

Para el presente estudio, se ha utilizado una proteína de fusión modificadora similar a la ubiquitina (SUMO) pequeña CVN en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas en lugar de CV-N y es adecuada para ensayos basados en células. La proteína HA H3 del virus de la influenza A de longitud completa recombinante se obtiene comercialmente (consulte la Tabla de materiales) o se expresa en líneas celulares HEK293 de mamíferos y células de insectos infectados por baculovirus de acuerdo con los protocolos estándar¹². La proteína espiga Wuhan-1 se expresa en células HEK293 de mamíferos. La síntesis de péptido monomanosilado (MM) y péptido dimanosilado (DM) permite la detección de ligandos homogéneos a CVN2 y molécula pequeña monomanosilada¹⁰.

1. Creación de construcciones CV-N

1. Para cada una de las variantes CVN2 y la proteína CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), obtenga la construcción del gen con una secuencia líder pelB N-terminal y una etiqueta His en el vector pET27b(+) de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales, Archivo Suplementario 1).
2. Obtener CVN2L0 y sus variantes (V2, V3, V4 y V5; Figura 2A,C) en el fondo de un gen plantilla CVN2L0 que consiste en dos secuencias de ADN distintas para cada repetición CV-N.
3. Disolver el ADN plásmido liofilizado en agua destilada desionizada estéril (_ddH2O) hasta una concentración final de 100 ng/μL.

2. Preparación de placas de LB-agar con células transformadas en ADN plásmido

1. Preparar el medio de cultivo LB-Lennox disolviendo 10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl en_ddH2O(ver Tabla de materiales), y ajustar el pH a 7,4. Realizar la transformación en E. coli competente BL21 (DE3) para cada variante (V2-V5) por método químico siguiendo un informe previamente publicado¹⁰.
2. Divida la solución (900 μL y 100 μL), transfiera 100 μL en placas de agar LB (50 μg/ml de kanamicina) y use suavemente un esparcidor celular estéril. Incubar las placas de agar durante la noche a 37 °C.

3. Clonación

1. Subclone el gen CV-N en los sitios NdeI y BamHI de pET11a (ver Tabla de materiales) para su transformación (electroporación) en células electrocompetentes siguiendo la referencia²⁷.

4. Mutagénesis dirigida al sitio

1. Para generar CVN2L0²⁹ y CVN-E41A mutante en el fondo de un gen plantilla CVN2L0 que contiene dos secuencias de ADN distinguidas para cada CV-N repita²⁷.
2. Realizar mutaciones utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio (ver Tabla de materiales) y cebadores mutagénicos específicos 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' y 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' para ejecutar la PCR³¹.
   1. Comience una serie de reacciones de muestra utilizando múltiples concentraciones de plantilla de ADN bicatenario (dsDNA) que van desde 5-50 ng (por ejemplo, 5, 10, 20 y 50 ng de plantilla de dsDNA). Mantenga constante la concentración del cebador.
      NOTA: La mezcla de PCR y el protocolo de ciclo térmico se utilizan generalmente como se describe en el manual de instrucciones para el kit de mutagénesis dirigida al sitio³².
3. Agregue la enzima de restricción Dpn I (1 μL, 10 U/μL, consulte la Tabla de materiales) debajo de la superposición de aceite mineral. Mezclar bien y suavemente las reacciones, girar hacia abajo en una microcentrífuga de mesa durante 1 minuto e incubar inmediatamente a 37 °C durante 1 h para digerir el dsDNA superenrollado parental.

5. Transformación de células bacterianas

1. Descongele suavemente las células supercompetentes XL1-Blue (consulte la Tabla de materiales) sobre hielo. Para transformar cada reacción de control y muestra, alícuota las células supercompetentes (50 μL) en un tubo de fondo redondo de polipropileno preenfriado (14 ml).
   1. Transferir 1 μL del ADN monocatenario tratado con Dpn I (ADNss) de cada reacción de control y muestra (ssDNA mutado) a alícuotas separadas de las células supercompetentes, que sintetizan la cadena complementaria. Agite las reacciones de transformación cuidadosamente para mezclar e incubar las reacciones en hielo durante 30 minutos.
      NOTA: Antes de transferir el ADN tratado con Dpn I a la reacción de transformación, se recomienda eliminar cuidadosamente cualquier aceite mineral restante de la punta de la pipeta. Como control opcional, la eficiencia de transformación de las células supercompetentes XL1-Blue debe verificarse mezclando 0,1 ng/μL del plásmido de control pUC18 (1 μL) con una alícuota de 50 μL de las células supercompetentes.
2. Aplicar pulso de calor a las reacciones de transformación a 42 °C durante 45 s y, a continuación, colocar las reacciones en hielo durante 2 min.
   NOTA: El pulso de calor aplicado ya ha sido optimizado para las condiciones mencionadas en tubos de fondo redondo de polipropileno (14 mL).
3. Añadir 0,5 ml de caldo NZY+ (conteniendo por litro: 10 g de amina NZ (hidrolizado de caseína), 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl 2, 12,5 mL de 1 M MgSO₄, 10 mL de glucosa₂ M, pH 7,5, y precalentado a 42 °C) e incubar las reacciones de transformación a 37 °C con agitación a 225-250 rpm durante 1 h. Placa el volumen correcto de cada reacción de transformación (5 μL de transformación plásmida de control; 250 μL de transformación de muestra) en placas de agar LB-ampicilina.
   NOTA: Para los controles de transformación y mutagénesis, diseminar células en placas de agar LB-ampicilina que tienen 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal, 80 μg/ml) e isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido (IPTG, 20 mM) (ver Tabla de materiales). Inocular 50 mL de los cultivos celulares con una sola colonia de E transformada. células coli para purificar el ADN plásmido mutado para análisis. La mutagénesis se confirma mediante secuenciación de ADN en una instalación externa.

6. Expresión y purificación de proteínas

1. Para un cultivo a gran escala, inocular una pequeña cantidad de LB (que contiene ampicilina) con una sola colonia de la placa transformada.
2. Usando el cultivo nocturno, inocular el cultivo de expresión con aditivos, como 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄ y 20 mM de glucosa, diluyendo el cultivo de semillas a 1/100.
   1. Cultivar células con agitación vigorosa a 37 °C. Cultivar células a un Abs 600 nm entre 0.4-0.6 (fase logarítmica media) antes de enfriar las células a 20 °C. Inducir con 1 mM IPTG y crecer durante la noche.
   2. A continuación, cosechar las células centrifugando a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C, y desechar el sobrenadante con una pipeta.
3. Resuspender el pellet celular en tampón salino tamponado con fosfato (PBS) y volver a centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. A continuación, deseche el sobrenadante con una pipeta. Resuspender el pellet restante en 10 ml de tampón de lisis e incubar la suspensión durante 1 h a 37 °C.
   NOTA: Composición del tampón de lisis: (50 mM de NaH 2 PO₄, 300 mM de NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/mL de lisozima, 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 1 mM de ditiothreitol, 1 mM de MgCl₂, pH 8, ver Tabla de materiales).
   1. Someter la mezcla a dos ciclos de congelación-descongelación (-80 °C). Separar las fracciones solubles e insolubles por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C y analizarlas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en particular, dodecil sulfato de sodio (SDS)-PÁGINA³³ (Figura 2B,C).
      NOTA: Las células se pueden lisar de varias maneras, como congelación-descongelación, sonicación, homogeneización, lisis enzimática o una combinación de estos métodos. Se recomienda la purificación de cuerpos de inclusión para recolectar altos rendimientos proteicos²⁶.
4. Purificar las proteínas mediante cromatografía en columna de Ni-NTA (consulte la Tabla de materiales). Cargue la fracción soluble en una columna de perlas de Ni-NTA regenerada (1 ml/min). Lavar el sistema con tampón TBS (50 mM de Tris, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,5) antes de iniciar un gradiente (0-100% 500 mM de imidazol en TBS durante 60 min) y fracciones colectoras (1 mL/min). Dializar las proteínas purificadas para caracterización bioquímica contra 100 mM PBS (Figura 2C,D).
5. Alternativamente, use el gel de afinidad His-Select Ni 2+ (consulte la Tabla de materiales) en tubos de 14 ml para unir y volver a suspender su CV-N expresado recombinantemente en soluciones tampón con 20 mM de imidazol y²⁵⁰ mM de imidazol, respectivamente. Incubar en lote durante al menos 30 min.
   NOTA: Aplique estas proteínas semipurificadas a una columna preempaquetada de un solo uso para el intercambio amortiguador y la limpieza de muestras biológicas, por ejemplo, carbohidratos y proteínas, que pueden cargar 1-1.5 ml de eluido de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada.
6. Transfiera las soluciones proteicas a tubos de centrifugación con un filtro de corte de 10 kDa (ver Tabla de materiales) y concéntrelas centrifugando durante 10 min a 4.500 x g y 4 °C. Para mediciones de SPR, cambie las soluciones de analito a 10 mM de HEPES, 150 mM de cloruro de sodio, 3 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,05% de Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), ver Tabla de materiales).
   1. Añadir este tampón de funcionamiento SPR a un factor de dilución de 1:10 y centrifugar cuatro veces hasta el volumen inicial durante 10 min a 4.500 x g y 4 °C.
7. Determinar la concentración de proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop UV-Vis (ver Tabla de materiales) basado en el coeficiente de extinción calculado (20,440 M-1 ^cm-1) para la proteína principal CVN2L0 que muestra un tamaño de 23,474 Da³⁴. Use PBS (100 mM, pH 7.0) o tampón SPR como espacio en blanco, y mida la concentración de proteína en tres pasos de dilución (1:1, 1:10 y 1:100).

Figura 2: Secuencias y expresión de CV-N . (A) CVN2 sin un enlazador entre cada repetición CV-N (101 aminoácidos cada una) y cuatro puentes disulfuro se expresa en el vector pET11a en E. coli. (B) Expresiones de dos colonias independientes para CV-N (monómero) y CVN2 (dímero). (C) Las variantes de enlace disulfuro se purifican y analizan en SDS-PAGE. Se utiliza como referencia un marcador de bajo peso molecular (6 μL). WT = CVN2L0 con cuatro puentes disulfuro marcados en (A). V2 es una variante con un reemplazo de enlace disulfuro por residuos polares en las posiciones 58 y 73. V3-V5 son variantes con dos enlaces S-S restantes y sustituyen aminoácidos polares (C58E-C73R) o no polares (C58W-C73M) o una combinación de estas sustituciones de pares de residuos. (D) Los cromatogramas HPLC de CVN2L0 purificado se eluyen a un caudal de 1 ml/min con un gradiente lineal del 5% al 65% del tampón B en el tampón A durante 30 min. El tampón A es: 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético en_ddH2O, tampón B es: 0,08% (v/v) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. La proteína se analiza en una columna de gel de sílice de alto rendimiento 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) a 214 nm y 280 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Espectroscopia SPR

1. Utilice el sistema SPR de doble canal (consulte la Tabla de materiales) con tampón de funcionamiento HBS-EP(+) y 10 mM de glicina HCl pH 1.5-1.6 como tampón de regeneración. Encienda el instrumento, el desgasificador, el muestreador automático y la bomba y lave todo el sistema con ddH₂0 durante 1 h. Coloque el búfer de ejecución listo para usar en una botella separada.
2. Deje caer el aceite de emersión sobre el detector y monte un chip sensor de vidrio (consulte la Tabla de materiales) recubierto con una fina película de oro y en la parte superior funcionalizado con hidrogel de carboximetildextrano directamente en el detector debajo de la celda de flujo de tres puertos. Corrija la configuración tirando hacia abajo el manejo.
   NOTA: C19RBDHC30M 200 nm estreptavidina derivatizado carboximetildextrano hidrogel con una densidad media de biotinilated síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 RBD proteína, es un chip sensor listo para usar con el ligando preinmovilizado.

8. Ensayo de unión SPR para la unión CV-N a HA, proteína S y RBD

1. Inmovilizar los ligandos proteicos a chips sensores siguiendo los pasos a continuación.
   1. Abra una tabla de ejecución haciendo clic en Formulario en la barra de menú y Ejecutar editor de tablas en el software SPRAutoLink integrado (consulte Tabla de materiales). Elija y haga clic en BASIC_Immobilization de la lista de tablas de ejecución disponibles y siga los pasos del procedimiento experimental en la pantalla de la computadora. El editor de muestras respectivo utilizado se muestra en la esquina superior derecha.
   2. Haga clic en Editor de conjuntos de muestras en la sección Formulario para completar la lista de reactivos de dos bastidores colocados en el muestreador automático para análisis adicionales. Haga clic en Autosampler Direct Control como una "Herramienta" en la barra de menú para llevar los bastidores hacia adelante o de vuelta a casa. Elija 4 °C como temperatura de funcionamiento.
      NOTA: El software SPR permite "Control directo del instrumento SPR" y "Control directo de la bomba" seleccionando las herramientas correspondientes, así como el manejo automático del muestreador, y haciendo clic en Formulario; también se puede elegir Ejecutar editor de tablas, Data-Plot o Post-Processing para realizar el análisis de datos. Los archivos se guardan directamente en el directorio predeterminado y se exportan como scrubber.files desde la ventana Post-Procesamiento.
2. Encienda la bomba para infundir ddH₂0 haciendo clic en Herramientas y Control directo de la bomba y registre los datos haciendo clic en Control directo del instrumento SPR, y cada vez que comience en las ventanas que aparecen de nuevo. Coloque los reactivos de acoplamiento (paso 8.3) en viales de 300 μL, colóquelos en los bastidores del muestreador automático e inicie la tabla de ejecución haciendo clic en Ejecutar.
   NOTA: Las superficies de los chips se acondicionan con un tampón de glicina de 10 mM pH 9.0 o pueden haberse lavado con cloruro de sodio 1 M, tampón de borato de sodio 0.1 M pH 9.0 para acondicionar la superficie del chip derivado de carboxilo para la mezcla de activación EDC / NHS³⁰.
3. Para esta simple interacción proteína-proteína, use el chip CMD500D (consulte la Tabla de materiales) para generar unidades de índice de microrrefracción (μRIU) = 2500 - 3000 células de flujo con HA inmovilizado y μRIU = 400 células de flujo con proteína de pico. A un caudal de infusión de 15 μL/min, inyectar una mezcla acuosa e igual de 0,4 M de clorhidrato de N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC*HCl) y 0,1 M N-hidroxisuccinimida (NHS) aplicando los siguientes pasos secuenciales.
   1. Rellene la recarga de la bomba a 25.000 μL/min, realice el ajuste de referencia durante 30 s, inyecte 90 μL de solución de activación de muestra (EDC/NHS) durante 6 minutos de tiempo de contacto y luego mantenga durante otros 5 minutos.
   2. Repita este ciclo después de la línea de base durante 1 minuto a 10 μL / min solo en la celda de flujo izquierdo (azul) para inyectar e inmovilizar los péptidos¹⁰, HA y proteína de pico sintetizados químicamente a 20 μg / ml, y permita el ajuste de línea de base posterior con ddH₂O durante 1.5 min antes de apagar la superficie del chip activado con 1 M etanolamina HCl pH 8.5.
4. Cambie los tubos del muestreador de líquido al desgasificador de ddH₂0 en la botella con HBS-EP(+) (Figura complementaria 1).
5. Analizar los sensorgramas SPR.
   1. Para realizar estudios cinéticos, utilizar diversas concentraciones de analito (^10-5-10-8 M), con un paso de regeneración después de cada inyección y mediciones en blanco después de diferentes analitos. Cambie el caudal a 10 μL/min e inicie las inyecciones durante 4 minutos de tiempo de contacto, luego 5 min de generación basal y dos pasos de regeneración de 2 min cada uno con un intervalo de 30 s.
   2. Inyecte la solución tampón para mediciones en blanco cuyos sensorgramas se restan de las muestras para normalizar diferentes concentraciones de proteínas.
6. Haga clic en Formulario, desplácese hacia abajo y cambie a "Post-Procesamiento" haciendo clic en este modo de operación. Haga clic en Agregar para seleccionar las curvas de enlace generadas a lo largo del tiempo en el formulario de trazado de datos para cada celda de flujo y exporte la superposición como un archivo depurador (.ovr). Haga clic en Archivo para abrir las opciones de guardado de archivos. Obtener curvas de respuesta alineando las curvas izquierda y derecha y restando señales del segundo canal de referencia de las del canal de ligando.
   NOTA: Los datos se operan en "Post-Procesamiento" definiendo sensorgramas computacionalmente. Se coloca en una superposición de sensorgramas de células de flujo izquierda y derecha, o se representa como sensorgramas a partir de la diferencia de ambos canales.
7. Limpie toda la fluida con 50-100 mM de tampón de glicina pH 9.5, agua y 20% de etanol antes y después de las mediciones de unión para eliminar trazas de sal o cualquier contaminación por proteínas, o más estrictas, con 0.5% de SDS y glicina.
   NOTA: Para evitar daños en el instrumento, se recomienda verificar la estabilidad mecánica del chip de vidrio antes de volver a insertar el cartucho de chip en el instrumento si los chips se han almacenado bajo tampón o al 100% de humedad.

Una molécula CVN2L0 intercambiada en dominio dimérico se prueba para unirse a la región superior de HA en tres experimentos SPR separados y la afinidad de unión se presenta en valores KD. Se supone que el dominio B comprende sitios de unión H, que se ven afectados por la sustitución de un enlace disulfuro en residuos iónicos, y el dominio A forma L10,18. Las inyecciones individuales de CVN2L0 y las variantes V2 (tres puentes disulfuro) y V5 (dos puentes disulfuro) se prueban primero para la unión al chip sensor acoplado a HA para estimar las capacidades de unión antes de configurar la medición cinética utilizando el muestreador automático y el editor de tablas de ejecución (Figura 3A y Figura complementaria 2). Las inyecciones repetidas se automatizan para una serie de CVN2L0, V2 y V5 a varias concentraciones en el rango nanomolar y μ-molar en el sistema a lo largo del tiempo (Figura 3B-D). Correlacionando el número de enlaces Cys-Cys intactos, CVN2L0 se une HA inmovilizado a KD = 255 nM cuando se alcanza una buena saturación. En este caso, ambos valoresK D, calculados a partir de datos cinéticos o ajustando los datos de equilibrio a la isoterma de unión de Langmuir, están en concordancia moderada (Tabla 1 y Figura complementaria 3, Figura complementaria 4).

Figura 3: Ensayo de unión SPR para la unión de ligandos a través de interacciones multivalentes. CVN2 (WT) y las variantes del sitio de unión V2 y V5 con reemplazos de disulfuro en el bolsillo de unión de carbohidratos de alta afinidad se prueban para unir HA inmovilizado covalentemente. (A) Las curvas de unión de celdas de flujo izquierdo y derecho de CVN2, V2 y V5 se pueden extraer del protocolo de ejecución SPR, y los sensorgramas se resumen en una superposición. (B) Sensorgrama del experimento SPR convencional mostrado como análisis cinéticos para la unión de CVN2L0 a HA, inyectando concentraciones de analitos de 10-4 a 10-8 M. CVN2L0 se mide hasta la concentración más alta a 1,5 μM (línea superior) y hasta 500 nM (línea inferior), para lo cual no se logra saturación en la superficie del chip ni unión de equilibrio. RU = Unidades de respuesta. Se utiliza un chip sensor CMD500D. (C) Sensorgrama SPR para la unión V2 a HA. (D) V5 vinculante a HA. La figura (B-D) se reproduce con permiso de la referencia10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Afinidades de unión de CVN2 y variantes a HA medidas a través de SPR. Scrubber 2.0 (un software de BioLogic) se utiliza para ajustar las curvas de asociación y disociación SPR en tiempo real y para calcular las constantes de disociación de equilibrio (KD) a partir de datos cinéticos y de equilibrio. Ka = constante de velocidad de asociación. Kd = constante de la tasa de disociación.

Mientras que los valores de KD para la unión de CVN2L0 y V2 a HA están ambos en el rango nanomolar, V5 disminuye en la unión (Tabla 1). En V5, dos enlaces disulfuro son reemplazados por residuos de apareamiento iónico que reentrenan las posibles interacciones iónicas entre los residuos mutados de Glu y Arg (Figura 2A, 3D). Los datos primarios se analizan siguiendo las ecuaciones integradas de tasa de asociación y velocidad de disociación, que describen la cinética de unión de la interacción de CV-N soluble con ligando inmovilizado y la disociación del complejo formado de la superficie del chip. Se realizan dos mediciones independientes y se analizan sensorgramas equivalentes a los obtenidos a partir de réplicas. KD se calcula como el cociente de koff/kon (Tabla suplementaria 1)10,35. Sin embargo, KD está relacionado con los datos de equilibrio que se ajustan a la isoterma de unión de Langmuir 36, donde la respuesta de unión de equilibrio se traza en función de la concentración del analito (Figura suplementaria 3A,4A,3B,4B). De una manera dependiente de la concentración, la constante de la tasa de disociación kd se determina después del análisis y se incorpora al ajuste de la fase de asociación (kon) para estimar la constante de tasa de asociación ka. (Tabla 1, Figura complementaria 3C, Figura complementaria 4C).

A continuación, la unión de CV-N a HA se compara con su interacción con RBD. La unión de CV-N WT a RBD del SARS-CoV-2 se mide con una afinidad más débil (K D = 260 μM, Figura 4A) en comparación con la unión a HA (KD = 5.7 nM)8,10,12 y la unión a la proteína S (KD = 18.6 μM, Figura 5). La concentración versus respuesta se traza para la unión de CV-N WT a RBD, asumiendo una orientación específica de carbohidratos posiblemente conservados en la subunidad RBD S1 (Figura 4A). La misma gráfica de afinidad se muestra para la unión CVN2L0-V4 a DM que ya no es analizable debido a la sustitución de enlaces disulfuro que interfieren con la unión de alta afinidad a péptidos glicosilados pequeños (Figura 4B).

CVN2L0-V4 (2 enlaces disulfuro opuestos al reemplazo asimétrico de residuos de cisteína por residuos de Glu-Arg o aminoácidos anfipáticos Trp y Met) puede formar redes de enlaces de hidrógeno no polares alrededor del sitio de unión de carbohidratos del pseudodominio B10. Una mayor densidad de glicanos en la proteína HA alcanza la unión con residuos polares de Glu-Arg en lugar de cistinas (Tabla suplementaria 1), y una asociación con péptidos manosilados (KD = 10 μM para DM) entre CVN2L0 y modificaciones en Glu-Arg, pero muestra una disociación discontinua de variantes de este péptido monoglicosilado, en particular cuando H se modifica en ambos monómeros. Para la interacción entre CVN2L0-V4 con DM, la respuesta de la inyección CVN2L0-V4 de 56 μM produce una respuesta mayor que Rmax. (Figura 4B). V5 (2x Glu-Arg) falla en la disociación de la DM ligada a la superficie (datos no mostrados). En resumen, las curvas de respuesta de concentraciones más bajas disminuyen antes de finalizar la inyección para todos los sensorgramas en CVN2 que se une al péptido sin H nativo y la unión del monómero a RBD.

Figura 4: Análisis SPR de (A) CV-N WT de unión al monómero RBD. K D se calcula ajustando datos cinéticos (lado izquierdo, K D = 260 μM) y se compara con datos de afinidad (lado derecho) utilizando un modelo biomolecular simple para la unión 1:1 entre ligando y analito (K D equil = 274 μM). La respuesta de enlace de equilibrio o la capacidad de unión se representa en función de la concentración en comparación con las curvas de unión SPR (0-605 μM CVN). H = Sitio de unión de alta afinidad. L = Sitio de unión de baja afinidad. Ambos se encuentran en CV-N y CVN2L0. (B) Dimeric CVN2L0-V4 unión a DM, suponiendo 2L sin KD analizable. Las concentraciones de CVN2L0-V4 son 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Unión mutante de CVN-E41A y CV-N WT a la glicoproteína (A) S. Las flechas indican el comienzo de la fase de asociación y disociación. (B) CVN-E41A que se une a RBD en SARS-CoV-2. Los ligandos se inmovilizan previamente en chips de sensor de policarboxilato HC y CMD500D. La subunidad S1 de Covid-19 [Pinto, D. et al.26; y Barnes, C. et al.37] se utiliza para la inmovilización de RBD. Caudal: 30 μL/min, 25 °C; Datos sin procesar trazados. En comparación, se representa la unión de anticuerpos del suero sanguíneo humano a RBD con un factor de dilución de 1:200. (C) Ensayo SPR de unión de CV-N WT a glicoproteína S que se inmoviliza a un nivel de respuesta de 400 μRIU para capturar CV-N. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se ha demostrado antes que el CV-N monomérico con una sola L no puede unirse suficientemente a gp120, pero que la capacidad de neutralización del CV-N requiere la reticulación de dos sitios de unión de carbohidratos y se restaura predominantemente por dimerización para funcionalizar con 2H12,19. Por lo tanto, se expresa un mutante monomérico CVN-E41A, que se sospecha que desestabiliza el pseudodominio B o puede interrumpir la conectividad con el segundo dominio A, como se encuentra en CV-N WT. CVN-E41A monómero revela estabilidad al unirse a la proteína S similar al monómero CV-N. Aunque la respuesta SPR para concentraciones de analito de 605-680 μM da como resultado unidades de alta respuesta y sensorgramas SPR típicos para la unión CV-N WT y E41A, respectivamente, el mutante es inestable cuando se diluye (Figura 5).

Figura complementaria 1: Sensorgrama SPR para capturar el mimetismo de DM como parte de la parte superior de influenza HA. Captura de pantalla: Gráfico de datos SPR que muestra el protocolo de ejecución SPR para la inmovilización de DM en el chip sensor SPR CMD500D, que está recubierto con hidrogel de carboximetil dextrano de 500 nm y es adecuado para análisis cinéticos de analitos de bajo peso molecular en alta densidad de ligandos. Los chips sensores se montan directamente en el detector con aceite de emersión y se fijan debajo de una celda de flujo de tres puertos. Después de enfriar la superficie del chip activado con 1 M de etanolamina HCl pH 8.5, CVN2 se inyecta dos veces (concentración = 1 μM y 2 μM, respectivamente). Púrpura: Diferencia entre la celda de flujo 1 y la celda de flujo 2; La respuesta se registra en un intervalo de 0,2 s. Azul: Celda de flujo 1: 3000-4000 unidades de índice de microrrefracción (μRIU) recubiertas de una solución de 400 nM del ligando DM a una superficie carboxilada activada. Rojo: Celda de flujo de referencia 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Ejecución manual en el chip sensor CMD500D funcionalizado por HA que muestra la unión de los diméricos CVN2L0-V5, V2 y CVN2L0. A caudales de infusión de 30-50 μL/min, las variantes de enlace CVN2L0 y disulfuro expresadas con una etiqueta His y purificadas sobre Ni-NTA se inyectan en el rango medio de μM y se prueban para unirse a HA con una fase de asociación de 3 min y una fase de disociación de 2 min. Las inyecciones son V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subclonado a partir de una proteína SUMO-fusión (1 μM) y CVN2L0 (2 μM). El tampón de funcionamiento a pH fisiológico se utiliza para todos los experimentos a 25 °C. Todas las soluciones se desgasifican y filtran (0,2 μm) antes de inyectarlas en el sistema. Púrpura: Diferencia entre la celda de flujo 1 y la celda de flujo 2; la respuesta se registra en un intervalo de 0,2 seg. Azul: Celda de flujo 1: 2540 μRIU HA. Rojo: Celda de flujo de referencia 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Unión CVN2 a HA. Análisis de sensorgramas cuando las curvas se alinean automáticamente. (A) Sensorgramas a cero y alineados usando el software Scrubber (izquierda) y isoterma de unión que muestra la curva de respuesta dependiente de la concentración a analitos unidos (derecha). (B) Isoterma de unión expresada en porcentaje de capacidad. (C) Curvas teóricas de asociación y disociación ajustadas computacionalmente. D) Datos cinéticos sobre sensorgramas SPR sin curvas ajustadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Unión CVN2 a HA. Análisis de sensorgramas cuando las curvas se alinean manualmente. (A) Sensorgramas a cero y alineados usando el software Scrubber (izquierda) y isoterma de unión que muestra la curva de respuesta dependiente de la concentración a analitos unidos (derecha). (B) Isoterma de unión expresada en porcentaje de capacidad. (C) Curvas teóricas de asociación y disociación ajustadas computacionalmente. D) Datos cinéticos sobre sensorgramas SPR sin curvas ajustadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Datos cinéticos obtenidos de sensorgramas SPR para la unión de las variantes de enlace CVN2L0 y Cys-Cys V2, V4 y V5 a HA utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. KD [M] = k off/k on  o kd/ka. Todos los datos se generan a 25 °C en búfer HBS-EP(+): Haga clic aquí para descargar esta tabla.

El autor no tiene nada que revelar.