Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.
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Artículo de método
Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón
En este artículo
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Resumen
Resumen
La capa de epitelio pigmentado de la retina (EPR) se encuentra inmediatamente detrás de los fotorreceptores y alberga un sistema metabólico complejo que desempeña varios papeles críticos en el mantenimiento de la función de los fotorreceptores. Por lo tanto, la estructura y función del EPR son esenciales para mantener la visión normal. Este manuscrito presenta un protocolo establecido para el aislamiento primario de células RPE de ratón. El aislamiento de EPR es una gran herramienta para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patología del EPR en los diferentes modelos murinos de trastornos oculares. Además, el aislamiento de EPR puede ayudar a comparar células primarias de EPR de ratón aisladas de ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados, así como a probar medicamentos que pueden acelerar el desarrollo de la terapia para trastornos visuales. El manuscrito presenta un protocolo de aislamiento de EPR paso a paso; Todo el procedimiento, desde la enucleación hasta la siembra, dura aproximadamente 4 horas. Los medios no deben cambiarse durante 5-7 días después de la siembra, para permitir el crecimiento de las células aisladas sin perturbación. Este proceso es seguido por la caracterización de la morfología, pigmentación y marcadores específicos en las células a través de la inmunofluorescencia. Las células pueden pasar un máximo de tres o cuatro veces.
Introducción
Las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) se localizan entre la coroides y la retina neural, formando una monocapa simple de células cuboidales que se encuentra detrás de las células fotorreceptoras (PR)1. El EPR desempeña un papel crítico en el mantenimiento de un ambiente saludable para las células PR, principalmente al reducir la acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consiguiente daño oxidativo1. Las células del EPR supervisan muchas funciones, como la conversión y almacenamiento de retinoides, la absorción de luz dispersa, el transporte de líquidos e iones, y la fagocitosis de ....
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Protocolo
Los animales se utilizaron según las pautas del protocolo animal IACUC número 21063 de la Universidad de Oakland y las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.
1. Preparación de la solución
- Prepare los medios de cultivo celular RPE completos complementando el medio de águila modificada de Dulbecco / mezcla de nutrientes F-12 (DMEM / F12) con 25% de suero bovino fetal (FBS), 1.5% de penicilina/estreptomicina y 0.02% de gentamicina.
- Prepare la enzima A complementando 741 μL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con 127 μL de solución madre ....
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Resultados
Validación de la especificidad, pureza y función/formación de barrera de células aisladas del EPR
Las células aisladas se examinaron bajo un microscopio óptico para verificar su viabilidad, morfología y pigmentación. Se capturaron imágenes de P0 y P1 ( Figura 1A, B) e imágenes de P0 y P4 (Figura 1C, D) para mostrar los cambios en las células; forma, tamaño y pigmentación a medida que los pasajes avanzaban hacia el cuarto pasa.......
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Discusión
El protocolo actual es un procedimiento detallado informado, modificado y simplificado para el aislamiento de RPE de los ojos del ratón. El protocolo incluye enucleación, disección, recolección, siembra, cultivo y caracterización de células RPE aisladas de ojos de ratón.
Existen algunas limitaciones y pasos críticos que deben cumplirse para un aislamiento exitoso del EPR, como la edad de los ratones, el número de ojos disecados, el tamaño de la placa o plato de cultivo de tejidos y las precauc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses para declarar que son relevantes para el contenido de este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) fondo R01 EY029751-04
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vaso de precipitados : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | Para la enzima de trabajo, una |
| pipeta de transferencia graduada desechable: 3.2mL estéril | 13-711-20 | ||
| DMEM / F12 | gibco | 11330 | Medios para cultivar células EPP |
| Suero fetal bovino (FBS) | gibco | 26140079 | Para medios de cultivo celular RPE |
| completos Solución reactiva de gentamicina | gibco | 15750-060 | Para medios de cultivo celular RPE completos |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | Para enzimas de trabajo (A& B) |
| Heracell VISO 160i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hialuronidasa de testículos bovinos | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | Para trabajar la enzima A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Jeringa con aguja adjunta 21 G x 1 1/2 pulg., estéril, de un solo uso, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Tubo: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-RPE65 para ratones | Abcam, Cambridge, MA, EE. UU | AB78036 | Para tinción de FI |
| Pluma | Strep gibco | 15140-122 Para medios completos de | cultivo celular RPE |
| Pinzas de acción positiva, estilo 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Tijeras Iris Estándar Recto 11,5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Centrífuga Sorvall St8 | Microscopio ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 | Zeiss | n/a | |
| Cuchilla quirúrgica, # 11, acero inoxidable | Bard-Parker | 371211 | |
| Plato de cultivo en suspensión de 60 mm x 15 mm Plato | 430589 | Corning | |
| : 100x20 mm estilo | Corning | 353003 | |
| Tubos Tornado: 15 ml | Midsci | C15B | |
| Tubos Tornado: 50 ml | Midsci | C50R | |
| tripsina EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | Para trabajar con enzima B |
| Pinzas 5MS, 8,2 cm, rectas, 0,09x0,05 mm Puntas | Pinzas Dumont | 501764 | |
| Positive Action Style 5, Biológico, Dumostar, Acabado pulido, 110 mm OAL | Microscopía Electrónica Ciencias Dumont | 50-241-57 | |
| Almohadillas, Moderadas : 23" X 36" | Tijeras de resorte McKesson | 4033 | |
| Vannas - 2,5 mm Filo de corte | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Referencias
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
