El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .
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Artículo de método
Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles
En este artículo
Resumen
Resumen
La malaria sigue siendo una de las enfermedades más devastadoras en todo el mundo y, hasta la fecha, la región africana sigue siendo responsable del 94% de todos los casos en todo el mundo. Esta enfermedad parasitaria requiere un parásito protozoario, un mosquito vector Anopheles y un huésped vertebrado. El género Anopheles comprende más de 500 especies, de las cuales 60 son conocidas como vectores del parásito. El género del parásito Plasmodium consta de 250 especies, y 48 de ellas están involucradas en la transmisión de enfermedades. Además, el parásito Plasmodium falciparum ha contribuido a un estimado del 99,7% de los casos de malaria en el África subsahariana en los últimos años.
Los gametocitos forman parte de la etapa sexual del parásito y son ingeridos por el mosquito hembra al alimentarse de un huésped humano infectado. El desarrollo adicional del parásito dentro del mosquito se ve reforzado por las condiciones ambientales favorables en el intestino medio del mosquito. Aquí, tiene lugar la fusión de los gametos femeninos y masculinos, y se originan los ookinetes móviles. Los ookinetes entran en el epitelio del intestino medio del mosquito, y los ookinetes maduros forman ooquistes, que, a su vez, producen esporozoítos móviles. Estos esporozoítos migran a las glándulas salivales del mosquito y se inyectan cuando un mosquito toma una comida de sangre.
Para fines de descubrimiento de fármacos, los mosquitos se infectaron artificialmente con sangre infectada con gametocitos en el ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA). Para detectar la infección dentro del mosquito y/o para evaluar la eficacia de los compuestos antipalúdicos, los intestinos medios de los mosquitos hembra se eliminaron después de la infección y se tiñeron con mercurocromo. Este método se utilizó para mejorar la detección visual de ooquistes bajo el microscopio para la determinación precisa de la prevalencia e intensidad del ooquiste.
Introducción
La malaria, conocida como una de las enfermedades más destructivas del mundo, todavía representa una gran amenaza para varios países, especialmente aquellos dentro de la región africana, y contribuye a aproximadamente el 95% de los casos en todo el mundo1. Esta enfermedad es causada por un parásito protozoario y, junto con su mosquito vector Anopheles, estos culpables pueden causar un gran daño al huésped humano2. Más específicamente, la especie falciparum del género parásito Plasmodium es responsable de aproximadamente el 99% de los casos de malaria en el África subsahariana1....
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Protocolo
Consulte la figura 1 para obtener una ilustración del protocolo. Se obtuvo la autorización ética del Comité de Ética de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pretoria (506/2018) para la extracción y el uso de sangre humana.
1. Cultura de gametocitos
NOTA: Antes de establecer el SMFA, se preparó un cultivo de gametocitos en la Universidad de Pretoria (ver Reader et al.22 para el protocolo completo).
- Preparar un cultivo de gametocitos que consista en gametocitos en estadio V de la cepa del parásito NF54.
- Asegurar que la g....
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Resultados
El número total de especímenes control disecados fue de 47, con una prevalencia promedio de 89% y una intensidad de 9,5 ooquistes por intestino medio (Tabla 1, como se publicó anteriormente22). Para el compuesto MMV1581558, el tamaño de la muestra alcanzó un total de 42 especímenes, con una prevalencia de ooquistes del 36% y una intensidad promedio de 1,5 ooquistes. Esto muestra una reducción en la prevalencia de ooquistes del 58% y un TRA del 82% en las tres réplicas biológicas (.......
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Discusión
Para que este protocolo se ejecute con éxito, se debe prestar atención a cada paso, aunque pueda ser un proceso tedioso y laborioso. Uno de los pasos más importantes es asegurar que el cultivo de gametocitos sea de buena calidad y que esté formado por gametocitos maduros, con la proporción correcta macho:hembra, antes de iniciar el SMFA23,24. Durante el SMFA, también es crucial mantener el cultivo de gametocitos a la temperatura correcta para evitar que los gamet.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Prof. Lyn-Mari Birkholtz y la Dra. Janette Reader del Departamento de Bioquímica, Genética y Microbiología, Instituto para el Control Sostenible de la Malaria, en la Universidad de Pretoria, por cultivar y suministrar el cultivo de gametocitos. La cepa del parásito se obtuvo de este último departamento (no forma parte de esta publicación). El Departamento de Ciencia e Innovación (DSI) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF); Iniciativa de Cátedras de Investigación de Sudáfrica (UID 64763 a LK y UID 84627 a LMB); las Comunidades de Práctica de la NRF (UID 110666 a LMB y LK); y las Asociaciones de Innovación Estratégica en Salud (S....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Intestino bovino/ | Compuesto de carnicería | ||
| MMV1581558 | MMV | Caja de respuesta a la pandemia | |
| Agujas de disección | WRIM | hecho a medida | |
| Lasec | |||
| Comederos de vidrio | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prisma (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Portaobjetos de microscopio | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS comprimidos | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Cabina de bioseguridad de metacrilato | Wits University | Hecho por los contratistas de Wits | |
| Vasos de plástico (350 mL) | Plastic Land |
Referencias
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M.
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Reimpresiones y permisos
