Artículo de método

Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

DOI:

10.3791/63547

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21 de abril de 2022

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1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualización de una amplia gama de biomarcadores específicos en los tejidos desempeña un papel vital en la exploración de las intrincadas organizaciones de los sistemas biológicos complejos. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas. Aquí, describimos una plataforma emergente de imágenes vibratorias altamente multiplexadas de proteínas específicas con sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar a través de imágenes electrónicas de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de colorantes Raman similares al arco iris. Este método elude el límite de los canales resolubles espectralmente en la inmunofluorescencia convencional y proporciona un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores en tejidos con resolución subcelular. Por lo general, es compatible con preparaciones de tejidos estándar, incluidos los tejidos fijos en paraformaldehído, los tejidos congelados y los tejidos humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE). Prevemos que esta plataforma proporcionará una imagen más completa de las interacciones proteicas de especímenes biológicos, particularmente para tejidos gruesos intactos. Este protocolo proporciona el flujo de trabajo desde la preparación de anticuerpos hasta la tinción de muestras de tejido, el ensamblaje del microscopio SRS y las imágenes de tejidos epr-SRS.

Introducción

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Los sistemas tisulares complejos están compuestos por distintas subpoblaciones celulares cuyas ubicaciones espaciales y redes de interacción están profundamente entrelazadas con sus funciones y disfunciones 1,2. Para revelar la arquitectura del tejido e interrogar su complejidad, el conocimiento de las ubicaciones espaciales de las proteínas a resolución de una sola célula es esencial. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes de proteínas altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas y podrían convertirse en una piedra angular para el estudio de la biología de los tejidos 3,4,5. Los métodos actuales comunes de imágenes de proteínas multiplexadas se pueden clasificar en dos categorías principales. Una es la imagen de inmunofluorescencia en serie que se basa en múltiples rondas de tinción e imágenes de tejidos, y la otra es la citometría de masa de imágenes junto con anticuerpos marcados con metales pesados 6,7,8,9,10,11,12.

Aquí, se introduce una estrategia alternativa para la obtención de imágenes de proteínas basadas en anticuerpos multiplexados. A diferencia de la modalidad de imágenes de fluorescencia prevalente, que solo puede visualizar 4-5 canales simultáneamente debido a los amplios espectros de excitación y emisión (ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) ~ 500 cm-1), la microscopía Raman exhibe un ancho de línea espectral mucho más estrecho (FWHM ~ 10 cm-1) y, por lo tanto, proporciona una multiplexidad escalable. Recientemente, aprovechando el espectro estrecho, se ha desarrollado un nuevo esquema de microscopía Raman llamado microscopía de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia electrónica (epr-SRS), que proporciona una poderosa estrategia para imágenes multiplexadas13. Al sondear los modos vibratorios acoplados electrónicamente de los tintes Raman, epr-SRS logra un efecto de mejora drástico de 1013 veces en las secciones transversales Raman y supera el cuello de botella de sensibilidad de la microscopía Raman convencional (Figura 1A)13,14,15. Como resultado, el límite de detección de epr-SRS se ha reducido a sub-μM, lo que permite la detección Raman de marcadores moleculares interesantes, como proteínas específicas y orgánulos dentro de las células13,16. En particular, utilizando anticuerpos conjugados con colorante Raman, se demostraron imágenes epr-SRS de proteínas específicas en células y tejidos (llamadas inmuno-eprSRS) con una sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar (Figura 1B)13,17. Al ajustar la longitud de onda de la bomba en solo 2 nm, la señal epr-SRS estará completamente apagada (Figura 1B), lo que muestra un alto contraste vibratorio.

En el lado de la sonda, se ha desarrollado un conjunto de sondas Raman similares al arco iris llamadas colorantes de dispersión Raman de Manhattan (MARS) para la conjugación de anticuerpos 13,18,19,20. Esta paleta Raman única consiste en nuevos tintes que llevan π triples enlaces conjugados (Material Suplementario), cada uno de los cuales muestra un pico epr-SRS único y estrecho en el rango espectral Bioorthogonal Raman (Figura 1C). Modificando la estructura del cromóforo central y editando isotópicamente ambos átomos del triple enlace (Material Suplementario), se han desarrollado sondas Raman separadas espectralmente. Aprovechando la multiplexidad escalable, la microscopía epr-SRS junto con la paleta de tintes MARS ofrece una estrategia óptica para imágenes de proteínas multiplex de una sola toma en células y tejidos.

Immuno-eprSRS proporciona una estrategia alternativa a los métodos actuales de imágenes de proteínas multiplex con fortalezas únicas. En comparación con los enfoques de fluorescencia con tinción cíclica, imágenes y eliminación de señales, esta plataforma basada en Raman garantiza la tinción e imágenes de una sola ronda. Por lo tanto, elude la complejidad práctica en los procedimientos cíclicos y simplifica en gran medida el protocolo, abriendo así nuevos territorios de imágenes de proteínas multiplexadas. Por ejemplo, aprovechando un protocolo de limpieza de tejidos adaptado a tinte Raman, immuno-eprSRS se ha extendido a tres dimensiones para el mapeo de proteínas altamente multiplexadas en tejidos gruesos intactos17. Se visualizaron más de 10 dianas proteicas a lo largo de tejidos cerebrales de ratón de un milímetro de grosor17. Más recientemente, también se ha demostrado el acoplamiento de inmuno-eprSRS con un protocolo optimizado de microscopía de expansión de retención de biomoléculas (ExM)21, imágenes a nanoescala de una sola toma de múltiples objetivos22. En comparación con la espectroscopia de masaspor imágenes 4,9, epr-SRS no es destructiva y tiene una capacidad de seccionamiento intrínsecamente óptica. Además, epr-SRS es más eficiente en el tiempo en la exploración de tejidos. Por lo general, una región tisular de 0,25 mm2 con un tamaño de píxel de 0,5 μm tarda solo unos minutos en obtener una imagen de un solo canal epr-SRS. Por ejemplo, el tiempo total de imagen de cuatro canales SRS más cuatro canales de fluorescencia en la Figura 4 es de aproximadamente 10 min.

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Protocolo

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El protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de experimentación animal (AC-AABD1552) aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia.

1. Preparación de anticuerpos conjugados con colorante Raman

  1. Prepare el tampón de conjugación como ~0.1 M NaHCO3 en tampón PBS, pH = 8.3, almacenar a 4 °C.
  2. Prepare la solución de sonda MARS (material suplementario) con función de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) como 3 mM en DMSO anhidro. La síntesis de las sondas MARS puede remitirse a los informes anteriores 13,17,18.
    NOTA: Para fines de almacenamiento, la solución de éster DE colorante NHS debe protegerse de la luz y mantenerse a -20 °C.
  3. Disolver los sólidos de anticuerpos en el tampón de conjugación a una concentración de 2 mg/ml. Para los anticuerpos que se disuelven en otros tampones, cámbielos en el tampón de conjugación a una concentración de 1-2 mg/ml con filtros centrífugos.
    NOTA: Se prefieren los anticuerpos secundarios altamente adsorbidos cruzados para la tinción multiplex para minimizar la reactividad entre especies. Los anticuerpos secundarios utilizados se enumeran en la Tabla 1 y en la Tabla de Materiales.
  4. Realizar la reacción de conjugación.
    1. Para los anticuerpos secundarios, agregue 15 veces el exceso molar de solución de colorante a la solución de anticuerpos en un vial de vidrio lentamente con agitación. Por ejemplo, en una solución de anticuerpos de 0,5 ml a 2 mg/ml, agregue una solución de colorante de 35 μL y 3 ml.
    2. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente (RT) con agitación durante 1 h. Proteja la reacción de la luz.
  5. Purificación.
    1. Prepare la suspensión de resina de filtración en gel (Tabla de materiales) en tampón PBS, siguiendo los pasos 1.5.2-1.5.4.
    2. Agregue 10 ml de polvo de resina de filtración de gel en 40 ml de tampón PBS dentro de un tubo de 50 ml.
    3. Mantenga la solución en un baño de agua a 90 °C durante 1 h.
    4. Decantar el sobrenadante y volver a añadir PBS a 40 ml. Conservar el purín a 4 °C.
    5. Empaque la columna de exclusión de tamaño (1 cm de diámetro, columnas de flujo por gravedad) con la solución de lodo a la altura de 10-15 cm.
    6. Enjuague y lave la columna con ~ 10 ml de tampón PBS para empacar aún más la resina.
    7. Pipetear la mezcla de reacción de conjugación (~0.5 mL) a la columna. Agregue inmediatamente 1 ml de tampón PBS como tampón de elución cuando se cargue toda la mezcla de reacción. Rellene constantemente el búfer de elución (PBS) en la columna.
    8. Recoja el eluido de la solución conjugada observando el color en la columna (los tintes MARS tienen colores verde claro a azul) o midiendo la absorbancia a 280 nm (A280).
  6. Concentre la solución recolectada a 1-2 mg/ml con un filtro centrífugo.
  7. Determine la concentración y el grado medio de etiquetado (DOL, relación colorante-proteína) midiendo el espectro ultravioleta-visible (UV-Vis) de la solución conjugada con un lector de placas Nano.
    NOTA: El material suplementario proporciona las propiedades de los ésteres NHS de colorante MARS para el cálculo. El DOL normal para el anticuerpo secundario es de alrededor de 3.

2. Preparación de muestras de tejido

  1. El paraformaldehído fijó los tejidos cerebrales del ratón.
    1. Anestesiar a los ratones (C57BL/6J, Hembra, 25 d postnatal) con isoflurano. Evalúe la anestesia adecuada con una prueba de pellizco del dedo del pie.
    2. Matar a los ratones por desplazamiento cervical. Perfundir los ratones inmediatamente con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS transcárdicamente.
    3. Recoge el cerebro del ratón, siguiendo los pasos 2.1.4-2.1.5
    4. Corte hacia arriba desde el tronco encefálico a lo largo de la sutura sagital. Pelar las dos mitades del cráneo hacia un lado y sacar el cerebro con una pinza.
    5. Fijar el cerebro recogido en 4% de PFA en PBS a 4 °C durante 24 h. Luego, lave el cerebro en tampón PBS a 4 ° C durante 24 h para eliminar el exceso de PFA.
    6. Coloque la agarosa sólida en agua a una concentración final del 7% (p/v) en un vaso de precipitados, con una tapa suelta. Revuelva la solución con una varilla de agitación de vidrio. Calentar la suspensión en el microondas hasta que la solución esté clara.
    7. Deje que la agarosa se enfríe a 45-55 °C.
    8. Vierta la agarosa líquida en una cámara pequeña, luego transfiera el cerebro de PBS a agarosa líquida y oriente con una espátula para incrustar el cerebro. Espere a que el bloque tejido-agarosa se endurezca.
    9. Seccione el tejido-agrose en rodajas coronales de 40 μm de espesor usando un vibratome.
    10. Transfiera el tejido a una placa de 4 pocillos para la siguiente tinción. Retire la agarosa con una pinza. Lave el tejido con 1 ml de PBS, tres veces.
  2. Tejidos pancreáticos de ratón congelados fijos.
    1. Fije la pancreata del ratón en PFA al 4% en PBS a 4 °C con balanceo durante 16-20 h.
    2. Lave la muestra en 1 ml de PBS (4 °C) tres veces para eliminar el PFA.
    3. Incruste la muestra (~ 0.3-0.5 cm de tamaño) en bloques compuestos de temperatura de corte óptima (OCT). Ponga 2 gotas de OCT en un criomold de plástico. Coloque el tejido en la orientación correcta y vierta LA OCT sobre los tejidos hasta que ninguno de los tejidos quede expuesto.
    4. Seccione la pancreata a rodajas de 8 μm de espesor y inmovibilícelas en un portaobjetos de vidrio de unión de tejido, guárdelas a -80 ° C.
    5. Antes de teñir, equilibre la muestra a RT. Lave el tejido con PBS para eliminar los bloqueos de OCT.
  3. Muestras de FFPE.
    1. Hornea el portaes de tejido FFPE a 60 °C durante 10 min.
    2. Desparafinación y rehidratación: Coloque las muestras secuencialmente en las siguientes soluciones en un tubo de 50 ml a RT durante 3 minutos cada vez con agitación leve:
      xileno dos veces,
      etanol dos veces,
      95% (vol/vol) de etanol en agua desionizada dos veces,
      70% (vol/vol) de etanol en agua desionizada dos veces,
      50% (vol/vol) de etanol en agua desionizada una vez,
      agua desionizada una vez.
    3. Transfiera la muestra a citrato de sodio de 20 mM (pH 8.0) a 100 °C en un frasco de vidrio. Asegúrese de que los tejidos estén sumergidos en la solución.
    4. Coloque el frasco en un baño de agua a 60 °C durante 45 min.
    5. Lave la muestra con agua desionizada en RT durante 5 min.

3. Tinción de inmuno-eprSRS tisular

  1. Use una pluma hidrofóbica para dibujar un límite alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva.
    NOTA: Se utiliza un frasco de tinción de diapositivas para seguir los pasos de incubación del tejido en el portaobjetos. Los tejidos flotantes (secciones cerebrales de ratón de 40 μm de espesor) se tiñen en placas de pozos.
  2. Incubar los tejidos con PBST al 0,3-0,5% (Tritón X-100 en PBS) durante 10 min.
  3. Incubar los tejidos con tampón de bloqueo (5% de suero de burro, 0,5% de Tritón X-100 en PBS) durante 30 min.
  4. Prepare la solución de tinción primaria: agregue todos los anticuerpos primarios a 200-500 μL de tampón de tinción (2% de suero de burro, 0.5% de Tritón X-100 en PBS) a las concentraciones deseadas. Centrifugar la solución de tinción primaria a 13.000 x g durante 5 min. Solo use el sobrenadante si se forman precipitados.
  5. Incubar el tejido en la solución primaria de anticuerpos a 4 °C durante 1-2 días.
    NOTA: Para teñir secciones de tejido en la diapositiva, coloque la muestra en una caja de tinción con una toallita húmeda para mantener la humedad.
  6. Lave las diapositivas tres veces con PBST al 0.3-0.5% en RT durante 5 minutos cada una. Use 1 ml de PBST para tejidos flotantes. Para los pañuelos en el portaobjetos, lave los portaobjetos en un frasco de tinción de portaobjetos y asegúrese de que todos los pañuelos estén sumergidos en la solución.
  7. Incubar el tejido en 200-500 μL de tampón de bloqueo durante 30 min.
  8. Preparar la solución de tinción secundaria: añadir todos los anticuerpos secundarios (y lectinas si es necesario) a 200-500 μL de tampón de tinción con las concentraciones deseadas (normalmente 10 μg/mL). Centrifugar la solución de tinción secundaria a 13.000 x g durante 5 min. Solo use el sobrenadante si se forman precipitados.
  9. Incubar los tejidos en 200-500 μL de solución secundaria de anticuerpos a 4 °C durante 1-2 días.
  10. Lave las diapositivas dos veces con PBST al 0.3-0.5% en RT durante 5 minutos cada una.
  11. Incubar con 200-500 μL de solución DAPI durante 30 min.
  12. Lave las diapositivas tres veces con PBS en RT durante 5 minutos cada una.
  13. Para las secciones de tejido flotantes, transfiéralas a portaobjetos de vidrio con una pipeta que deja caer vidrio. Extienda el pañuelo con un cepillo de pañuelos y limpie el entorno con toallitas si es necesario.
  14. Monte el tejido en una gota de reactivos antifasantes con una cubierta de vidrio y asegúrelo con esmalte de uñas.

4. Conjunto del microscopio SRS

NOTA: Un sistema de fluorescencia confocal comercial se utiliza en imágenes de fluorescencia SRS en tándem. Se pueden encontrar más descripciones en un informe anterior17. Este protocolo se centrará en el lado de las imágenes SRS utilizando excitación de banda estrecha.

  1. Prepare una mesa óptica aislada por vibración en una habitación con control de temperatura.
  2. Coloque un sistema sincronizado de doble láser (bomba y Stokes) en la mesa óptica (Figura 2A) con un enfriador conectado.
    NOTA: El láser fundamental en el sistema de láser dual proporciona un tren de pulsos de salida a 1064 nm con un ancho de pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz. El rayo Stokes es del láser fundamental. La intensidad del haz de Stokes fue modulada sinusoidalmente por un modulador de amplitud electroóptico (EOM) incorporado a 8 MHz con una profundidad de modulación de más del 90%. La otra parte del láser fundamental se duplica en frecuencia a 532 nm, que se utiliza además para sembrar sincrónicamente un oscilador paramétrico óptico de picosegundos (OPO) para producir un tren de pulsos bloqueado por modo con un ancho de pulso de 5-6 ps (el haz de ralentí del OPO se bloquea con un filtro interferométrico). La longitud de onda de salida del OPO es sintonizable de 720-950 nm, que sirve como haz de bomba.
  3. Monte los espejos (rango de longitud de onda: 750-1100 nm), los divisores de haz dicroico (DBS, filtro de paso largo de 980 nm, rectangular) y la lente (acromática, recubrimiento AR para 650-1050 nm) a sus respectivas monturas. Utilice soportes de espejo cinemáticos muy estables para los espejos y divisores de haz dicroico.
  4. Mida la altura de la salida del láser y los tamaños de haz de la bomba y los haces stokes. Ajuste la altura de los espejos y lentes para asegurarse de que la luz llegue al centro de todos los elementos ópticos.
  5. Coloque el espejo M1 en la mesa óptica y hágalo ~ 45 ° a la salida láser (Figura 2B). Utilice las perillas del soporte cinemático para realizar ajustes de punta e inclinación. Asegúrese de que la luz viaje a la misma altura a lo largo de la longitud de la mesa y una línea recta con respecto a la mesa.
  6. Coloque y alinee los divisores de haz dicroico (filtros de paso largo de 980 nm) y los espejos para dividir la bomba y los haces stokes (Figura 2A-B).
  7. Coloque y alinee los pares de lentes (L1, L2 y L3, L4) en cada una de las trayectorias del haz para colimar los haces y expandir los diámetros de los haces para que coincidan con la pupila posterior del objetivo (Figura 2A-B).
  8. Utilice espejos M7 y M8 para alinear los rayos láser combinados en el microscopio (Figura 2C). Alinee primero un haz en el microscopio y use los pares de espejos en el otro haz para garantizar la superposición espacial de los dos haces.
  9. Configure la parte de detección.
    1. Coloque un condensador de aceite con recubrimiento infrarrojo (1.4-NA) para recoger la bomba de avance y los haces stokes después de pasar a través de las muestras (Figura 2C).
    2. Monte un fotodiodo de Si de gran área en una caja blindada con conectores BNC (Figura 2E). Agregue una fuente de alimentación de 64 V CC al fotodiodo montado para aumentar su umbral de saturación y ancho de banda de respuesta.
    3. Refleja la luz hacia adelante con un espejo de 2 pulgadas. Vuelva a enfocar la luz en el fotodiodo después de un filtro óptico para bloquear el haz de Stokes modulante (Figura 2D).
    4. Envíe la corriente de salida del fotodiodo a un amplificador de bloqueo rápido terminado con 50 para la demodulación de la señal. Envíe un disparador de 8 MHz al amplificador de bloqueo como señal de referencia.
    5. Envíe el componente X en fase del amplificador de bloqueo a la caja de interfaz analógica del microscopio.
  10. Optimice la superposición temporal con la etapa de retardo motorizada incorporada midiendo la señal SRS del líquido puro D2O en el microscopio.

5. Adquisición y análisis de imágenes

  1. Realice imágenes epr-SRS multicanal con ajuste secuencial de la longitud de onda de la bomba.
    1. Ajuste la potencia del láser a la bomba P = 10-40 mW y PStokes = 40-80 mW en el panel de control láser.
    2. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 2-4 μs y use múltiples fotogramas con un promedio de 10-20 fotogramas en el software de microscopía.
      NOTA: Evite el uso combinatorio de alta potencia láser (bomba P> 40 mW, PStokes> 80 mW) y tamaño de píxel pequeño (<0,2 μm), que probablemente causen un "efecto blanqueador" de los tintes Raman debido a la excitación multifotónica.
    3. Ajuste las constantes de tiempo del amplificador de bloqueo a la mitad del tiempo de permanencia de píxeles.
  2. Desmezcla espectral lineal.
    NOTA: epr-SRS sigue una estricta dependencia lineal de señal a concentración en todo el rango de concentración; por lo tanto, la desmezcla espectral lineal es efectiva para eliminar cualquier posible diafonía entre canales. Para la medición epr-SRS de canal N con sondas N MARS, las señales medidas (S) se pueden expresar como S = MC, donde C son las concentraciones de la sonda MARS, y M es una matriz N x N determinada por secciones transversales Raman de sondas MARS.
    1. Mida la matriz M en muestras inmuno-eprSRS de un solo color marcadas con diferentes sondas MARS.
    2. Usa la ecuación C = M−1· S para determinar la matriz de concentración de la sonda MARS con medición de señal de muestra multiplex S.

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Resultados

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La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo de epr-SRS en diferentes muestras, incluyendo células fijas (Figura 3A), tejidos de ratón fijados en paraformaldehído (PFA) (Figura 3B) y especímenes humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE) (Figura 3C). La resolución espacial de la microscopía SRS es limitada por difracción, la resolución lateral típica es de ~ 300 nm y la resolución axial es de...

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Discusión

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Aquí, presentamos el protocolo immuno-eprSRS que es ampliamente aplicable a los tipos de tejidos comunes, incluidos los tejidos de ratón recién conservados, los tejidos humanos FFPE y los tejidos de ratón congelados. Immuno-eprSRS ha sido validado para un panel de epítopos en células y tejidos, como se indica en la Tabla 1. Esta plataforma one-shot es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias cíclicas no funcionan bien. Por ejemplo, la fluorescencia cíclica es exigente para los tej...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Ruth A. Singer y Richard K.P. Benninger por proporcionar tejidos de páncreas de ratón. W.M. agradece el apoyo de NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) y del Ejército de los Estados Unidos (W911NF-19-1-0214).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
16% Paraformaldehído,Microscopía Electrónica15710
α-tubulinaAbcamab18251Anticuerpos primarios
&alfa;-tubulinaBioLegend625902Anticuerpos
primariosβ-III-tubulinaBioLegend657402Anticuerpos primarios
β-III-tubulinaAbcamab41489Anticuerpos primarios
β-tubulinaAbcamab131205Anticuerpos primarios
Agarosa, baja temperatura de gelificaciónSigma AldrichA9414Para la inclusión cerebral
Anticuerpo anti-a-tubulina producido en conejo (&alfa;-tubulina)Abcamab52866Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Calbindina producido en ratón (Calbindina)Abcamab82812Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-GABA B receptor R2  producido en cobaya (GABA B receptor R2)Millipore SigmaAB2255Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-GFAP producido en cabra (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Anticuerpos primarios
Anti-Glucagón  anticuerpo producido en ratón (Glucagón)Santa Cruz Biotechnologysc-514592Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-insulina producido en conejillo de indias (insulina)DAKOIR00261-2Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-MBP producido en rata (MBP)Abcamab7349Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-NeuN producido en conejo (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Anticuerpos primarios
Anticuerpo polipéptido (PP) antipancreático producido en cabra- Polipéptido pancreático (PP)Sigma AldrichSAB2500747 Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Pdx1 producido en conejo (Pdx1)Milipore06-1379Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-somatostatina producido en rata (Somatostatina)Abcamab30788Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Vimentina producido en pollo ( Vimentin)Abcamab24525Anticuerpos primarios
Filtro de paso de bandaKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 OhmTerminator Mini CircuitosSTRM-50
Cable BNCThorlabs2249-CCable Coaxial, BNC Macho / Macho
Espejo dieléctrico de banda anchaThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6J ratonesCondensadorde
Inmersión en aceite Olympus, 1.4 N.A.
Citoqueratina 18Abcamab7797Anticuerpos primarios
Citoqueratina 18Abcamab24561Anticuerpos primarios
Fuente de alimentación de CCTopWard6302DEl voltaje de polarización es de 64 V
Montura dicroicaThorlabsKM100CLKinematic Mount para hasta 1,3" (33 mm) de altura Óptica rectangular, zurdo
Burro anti-pollo IgY (H+L)Jackson ImmunoResearch703-005-155Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Cabra IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-cobaya IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148Anticuerpos secundarios para la conjugación de
MARS Burro anti-Ratón IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Conejo IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Rata IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Sheep IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147Secundaria anticuerpos para la conjugación de MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916Anticuerpos primarios
EtanolSigma Aldrich443611
Amplificador de observación de alta velocidadZurich InstrumentsHF2LIDC - 50 MHz
FFPE Muestra de riñónUSBiomaxHuFPT072
FibrilarinaAbcamab5821Anticuerpos primarios
GiantinAbcamab24586Anticuerpos primarios
GlucagónSanta Cruz Biotechnologysc-514592Anticuerpos primarios
H2BAbcamab1790Anticuerpos primarios
HeLaATCC ATCC CCL-2
Filtro de paso de banda de alta densidad O.D. Chroma TecnologíaET890/220mFiltre el haz de Stokes y transmita el haz de la bomba
Pluma hidrofóbicaFisher ScientificNC1384846
Anticuerpos
primarios Sistema láser SRS integradoFísica aplicada & Electrónica, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD proporciona un tren de pulsos de salida a 1.064 nm con un ancho de pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz, que sirve como haz de Stokes. El haz de frecuencia duplicada a 532 nm se utiliza para sembrar sincrónicamente un oscilador paramétrico óptico (OPO) de picosegundos para producir un tren de pulsos de modo bloqueado con un ancho de pulso de cinco ~ 6 ps (el haz loco del OPO está bloqueado con un filtro interferométrico). La longitud de onda de salida del OPO es sintonizable desde 720 – 950 nm, que sirve como haz de bombeo. La intensidad del haz de Stokes de 1.064 nm está modulada sinusoidalmente por un EOM incorporado a 8 MHz con una profundidad de modulación de más del 90%. El haz de la bomba se superpone espacialmente con el haz de Stokes mediante el uso de un espejo dicroico dentro de picoEMERALD. La superposición temporal entre la bomba y los trenes de pulsos de Stokes se logra con una etapa de retardo incorporada y se optimiza mediante la señal SRS de D2O puro en el microscopio.
Microscopio láser de barrido invertidoOlympus FV1200MPE
Montaje de espejo cinemáticoThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Ajustadores hexagonales de perfil bajo
Lectina de Triticum vulgaris (trigo)Sigma AldrichL0636-5 mg
Divisor de haz dicroico de paso largoSemrockDi02-R980-25x36láser de 980 nm BrightLine  divisor de haz dicroico plano láser de un solo filo
MAP2BioLegend801810Anticuerpos primarios
Software de imagen para microscopíaOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanPara análisis de pequeños volúmenes basados en absorbancia en un lector de placas.
Suero de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Célula fija ReadyProbes Reactivo (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc Platos de 4 pocillosFisher Scientific12-566-300
Lente objetivoOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, distancia de trabajo =  2  mm
Pincel
Conjunto de periscopioThorlabsRS99incluye las unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" y horquilla de apriete.
Medidor
Lector de placasTecanInfinite 200 PROUn lector de placas multimodo fácil de usar. Capacidades de medición de absorbancia en un rango espectral de 230 – 1000 nm.
Reactivo antidecoloración ProLong GoldThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Anticuerpos primarios
Sephadex G-25 MedioGE Life Sciences17-0033-01Resina de filtración en gel para desalinización e intercambio de tampones
Caja blindada con conectores BNCPomona Electronics2902Caja de aluminio con tapa, BNC hembra/hembra
Si fotodiodoThorlabsFDS1010350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm
Sinapsina deThermoFisherOSS00073G Anticuerpos primarios
Camino del tejido Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813Portaobjetos adhesivos para atraer y unir químicamente secciones de tejido frescas o fijadas en formol firmemente a la superficie del portaobjetos (portaobjetos de vidrio aglutinante tiisue)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinaAbcamab8069Anticuerpos primarios
XilenosSigma Aldrich 214736
de Grado EM Ciencias centrífuga 000664 de laboratorio Jackson Insulina ThermoFisher 701265 de pH área activa 2

Referencias

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