Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

Summary

La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.

Abstract

La visualización de una amplia gama de biomarcadores específicos en los tejidos desempeña un papel vital en la exploración de las intrincadas organizaciones de los sistemas biológicos complejos. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas. Aquí, describimos una plataforma emergente de imágenes vibratorias altamente multiplexadas de proteínas específicas con sensibilidad comparable a la inmunofluorescencia estándar a través de imágenes electrónicas de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de colorantes Raman similares al arco iris. Este método elude el límite de los canales resolubles espectralmente en la inmunofluorescencia convencional y proporciona un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores en tejidos con resolución subcelular. Por lo general, es compatible con preparaciones de tejidos estándar, incluidos los tejidos fijos en paraformaldehído, los tejidos congelados y los tejidos humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE). Prevemos que esta plataforma proporcionará una imagen más completa de las interacciones proteicas de especímenes biológicos, particularmente para tejidos gruesos intactos. Este protocolo proporciona el flujo de trabajo desde la preparación de anticuerpos hasta la tinción de muestras de tejido, el ensamblaje del microscopio SRS y las imágenes de tejidos epr-SRS.

Introduction

Los sistemas tisulares complejos están compuestos por distintas subpoblaciones celulares cuyas ubicaciones espaciales y redes de interacción están profundamente entrelazadas con sus funciones y disfunciones ^1,2. Para revelar la arquitectura del tejido e interrogar su complejidad, el conocimiento de las ubicaciones espaciales de las proteínas a resolución de una sola célula es esencial. Por lo tanto, las tecnologías de imágenes de proteínas altamente multiplexadas han sido cada vez más apreciadas y podrían convertirse en una piedra angular para el estudio de la biología de los tejidos

Protocol

El protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de experimentación animal (AC-AABD1552) aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia.

1. Preparación de anticuerpos conjugados con colorante Raman

1. Prepare el tampón de conjugación como ~0.1 M NaHCO₃ en tampón PBS, pH = 8.3, almacenar a 4 °C.
2. Prepare la solución de sonda MARS (material suplementario) con función de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) como 3 mM en DMSO anhidro. La síntesis de las sondas MARS puede remitirse a los informes anteriores 13,17,18.

Results

La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo de epr-SRS en diferentes muestras, incluyendo células fijas (Figura 3A), tejidos de ratón fijados en paraformaldehído (PFA) (Figura 3B) y especímenes humanos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE) (Figura 3C). La resolución espacial de la microscopía SRS es limitada por difracción, la resolución lateral típica es de ~ 300 nm y la resolución axial es de.......

Discussion

Aquí, presentamos el protocolo immuno-eprSRS que es ampliamente aplicable a los tipos de tejidos comunes, incluidos los tejidos de ratón recién conservados, los tejidos humanos FFPE y los tejidos de ratón congelados. Immuno-eprSRS ha sido validado para un panel de epítopos en células y tejidos, como se indica en la Tabla 1. Esta plataforma one-shot es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias cíclicas no funcionan bien. Por ejemplo, la fluorescencia cíclica es exigente para los tej.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehído,	Microscopía Electrónica	15710
α-tubulina	Abcam	ab18251	Anticuerpos primarios
&alfa;-tubulina	BioLegend	625902	Anticuerpos
primariosβ-III-tubulina	BioLegend	657402	Anticuerpos primarios
β-III-tubulina	Abcam	ab41489	Anticuerpos primarios
β-tubulina	Abcam	ab131205	Anticuerpos primarios
Agarosa, baja temperatura de gelificación	Sigma Aldrich	A9414	Para la inclusión cerebral
Anticuerpo anti-a-tubulina producido en conejo (&alfa;-tubulina)	Abcam	ab52866	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Calbindina producido en ratón (Calbindina)	Abcam	ab82812	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-GABA B receptor R2  producido en cobaya (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-GFAP producido en cabra (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Anticuerpos primarios
Anti-Glucagón  anticuerpo producido en ratón (Glucagón)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-insulina producido en conejillo de indias (insulina)	DAKO	IR00261-2	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-MBP producido en rata (MBP)	Abcam	ab7349	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-NeuN producido en conejo (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Anticuerpos primarios
Anticuerpo polipéptido (PP) antipancreático producido en cabra- Polipéptido pancreático (PP)	Sigma Aldrich		SAB2500747 Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Pdx1 producido en conejo (Pdx1)	Milipore	06-1379	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-somatostatina producido en rata (Somatostatina)	Abcam	ab30788	Anticuerpos primarios
Anticuerpo anti-Vimentina producido en pollo ( Vimentin)	Abcam	ab24525	Anticuerpos primarios
Filtro de paso de banda	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm	Terminator Mini Circuitos	STRM-50
Cable BNC	Thorlabs	2249-C	Cable Coaxial, BNC Macho / Macho
Espejo dieléctrico de banda ancha	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J ratones	Condensador	de
	Inmersión en aceite Olympus		, 1.4 N.A.
Citoqueratina 18	Abcam	ab7797	Anticuerpos primarios
Citoqueratina 18	Abcam	ab24561	Anticuerpos primarios
Fuente de alimentación de CC	TopWard	6302D	El voltaje de polarización es de 64 V
Montura dicroica	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount para hasta 1,3" (33 mm) de altura Óptica rectangular, zurdo
Burro anti-pollo IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Cabra IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-cobaya IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Anticuerpos secundarios para la conjugación de
MARS Burro anti-Ratón IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Conejo IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Rata IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Anticuerpos secundarios para la conjugación de MARS
Burro anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secundaria anticuerpos para la conjugación de MARS
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Anticuerpos primarios
Etanol	Sigma Aldrich	443611
Amplificador de observación de alta velocidad	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Muestra de riñón	USBiomax	HuFPT072
Fibrilarina	Abcam	ab5821	Anticuerpos primarios
Giantin	Abcam	ab24586	Anticuerpos primarios
Glucagón	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticuerpos primarios
H2B	Abcam	ab1790	Anticuerpos primarios
HeLa		ATCC ATCC CCL-2
Filtro de paso de banda de alta densidad O.D. Chroma	Tecnología	ET890/220m	Filtre el haz de Stokes y transmita el haz de la bomba
Pluma hidrofóbica	Fisher Scientific	NC1384846
			Anticuerpos
primarios Sistema láser SRS integrado	Física aplicada & Electrónica, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD proporciona un tren de pulsos de salida a 1.064 nm con un ancho de pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz, que sirve como haz de Stokes. El haz de frecuencia duplicada a 532 nm se utiliza para sembrar sincrónicamente un oscilador paramétrico óptico (OPO) de picosegundos para producir un tren de pulsos de modo bloqueado con un ancho de pulso de cinco ~ 6 ps (el haz loco del OPO está bloqueado con un filtro interferométrico). La longitud de onda de salida del OPO es sintonizable desde 720 – 950 nm, que sirve como haz de bombeo. La intensidad del haz de Stokes de 1.064 nm está modulada sinusoidalmente por un EOM incorporado a 8 MHz con una profundidad de modulación de más del 90%. El haz de la bomba se superpone espacialmente con el haz de Stokes mediante el uso de un espejo dicroico dentro de picoEMERALD. La superposición temporal entre la bomba y los trenes de pulsos de Stokes se logra con una etapa de retardo incorporada y se optimiza mediante la señal SRS de D2O puro en el microscopio.
Microscopio láser de barrido invertido	Olympus FV1200MPE
Montaje de espejo cinemático	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Ajustadores hexagonales de perfil bajo
Lectina de Triticum vulgaris (trigo)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Divisor de haz dicroico de paso largo	Semrock	Di02-R980-25x36	láser de 980 nm BrightLine  divisor de haz dicroico plano láser de un solo filo
MAP2	BioLegend	801810	Anticuerpos primarios
Software de imagen para microscopía	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		Para análisis de pequeños volúmenes basados en absorbancia en un lector de placas.
Suero de burro normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Célula fija ReadyProbes Reactivo (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc Platos de 4 pocillos	Fisher Scientific	12-566-300
Lente objetivo	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, distancia de trabajo =  2  mm
Pincel
Conjunto de periscopio	Thorlabs	RS99	incluye las unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" y horquilla de apriete.
Medidor
Lector de placas	Tecan	Infinite 200 PRO	Un lector de placas multimodo fácil de usar. Capacidades de medición de absorbancia en un rango espectral de 230 – 1000 nm.
Reactivo antidecoloración ProLong Gold	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Anticuerpos primarios
Sephadex G-25 Medio	GE Life Sciences	17-0033-01	Resina de filtración en gel para desalinización e intercambio de tampones
Caja blindada con conectores BNC	Pomona Electronics	2902	Caja de aluminio con tapa, BNC hembra/hembra
Si fotodiodo	Thorlabs	FDS1010	350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm
Sinapsina de	ThermoFisher		OSS00073G Anticuerpos primarios
Camino del tejido Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Portaobjetos adhesivos para atraer y unir químicamente secciones de tejido frescas o fijadas en formol firmemente a la superficie del portaobjetos (portaobjetos de vidrio aglutinante tiisue)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentina	Abcam	ab8069	Anticuerpos primarios
Xilenos	Sigma Aldrich 214736