Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Patrícia M. S. dos Passos; Valentine Spagnol; Camila R.S.T.B de Correia; Felipe R. Teixeira

doi:10.3791/63561

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Artículo de método

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

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DOI:

10.3791/63561

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10 de mayo de 2022

Patrícia M. S. dos Passos^*¹ , Valentine Spagnol^*² , Camila R.S.T.B de Correia¹ , Felipe R. Teixeira¹^,²

¹Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, ²Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Resumen

La ubiquitilación es una modificación post-traduccional que ocurre en las células eucariotas que es crítica para la regulación de varias vías biológicas, incluida la supervivencia, proliferación y diferenciación celular. Es un proceso reversible que consiste en una unión covalente de ubiquitina al sustrato a través de una reacción en cascada de al menos tres enzimas diferentes, compuestas de E1 (enzima de activación de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de ubiquitina) y E3 (enzima ubiquitina-ligasa). El complejo E3 juega un papel importante en el reconocimiento y ubiquitilación del sustrato. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la ubiquitilación del sustrato en células de mamíferos utilizando la coinfección transitoria de un plásmido que codifica el sustrato seleccionado, una ubiquitina ligasa E3 y una ubiquitina etiquetada. Antes de la lisis, las células transfectadas se tratan con el inhibidor del proteasoma MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) para evitar la degradación proteasómica del sustrato. Además, el extracto celular se somete a inmunoprecipitación a pequeña escala (IP) para purificar el sustrato poliubiquitilado para su posterior detección por western blotting (WB) utilizando anticuerpos específicos para la etiqueta de ubiquitina. Por lo tanto, se describe un protocolo consistente y sin complicaciones para el ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos para ayudar a los científicos a abordar la ubiquitilación de sustratos específicos y las ligasas de ubiquitina E3.

Introducción

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) son un mecanismo importante con respecto a la regulación de proteínas, que es esencial para la homeostasis celular. La ubiquitilación de proteínas es una modificación dinámica e intrincada que crea una variedad de señales diferentes que resultan en varios resultados celulares en organismos eucariotas. La ubiquitilación es un proceso reversible que consiste en la unión de una proteína de ubiquitina que contiene 76 aminoácidos al sustrato, que se produce en una cascada enzimática compuesta por tres reacciones distintas¹. El primer paso se caracteriza por la activación de la ubiquitina, que depende de u....