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Artículo de método

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

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DOI:

10.3791/63570

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2 de mayo de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Illinois Wesleyan University, 2Department of Biosciences, Rice University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.

Resumen

Las heridas corneales embrionarias de los pollitos muestran una notable capacidad para regenerarse completa y rápidamente, mientras que las córneas heridas adultas experimentan una pérdida de transparencia debido a la cicatrización fibrótica. La integridad tisular de las córneas embrionarias lesionadas se restaura intrínsecamente sin formación de cicatrices detectables. Dada su accesibilidad y facilidad de manipulación, el embrión de pollito es un modelo ideal para estudiar la reparación de heridas corneales sin cicatrices. Este protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Primero, los óvulos se ventanan a edades embrionarias tempranas para acceder al ojo. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones in ovo físicas a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea. En tercer lugar, las heridas lineales de la córnea que penetran en la capa epitelial externa y el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida. Los estudios realizados hasta la fecha utilizando este modelo han revelado que las córneas embrionarias heridas muestran activación de la diferenciación de queratocitos, se someten a una remodelación coordinada de las proteínas ECM a su macroestructura tridimensional nativa y se vuelven a inervar adecuadamente por los nervios sensoriales corneales. En el futuro, el impacto potencial de los factores endógenos o exógenos en el proceso regenerativo podría analizarse en la curación de córneas mediante el uso de técnicas de biología del desarrollo, como el injerto de tejido, la electroporación, la infección retroviral o la implantación de perlas. La estrategia actual identifica al pollito embrionario como un paradigma experimental crucial para dilucidar los factores moleculares y celulares que coordinan la cicatrización de heridas corneales sin cicatrices.

Introducción

La córnea es el tejido transparente y externo del ojo que transmite y refracta la luz que conduce a la agudeza visual. En la córnea adulta, el daño o la infección del estroma corneal conduce a una respuesta de cicatrización de heridas rápida y robusta caracterizada por proliferación de queratocitos, fibrosis, aumento de la inflamación que conduce a la apoptosis inducida por citoquinas, generación de miofibroblastos reparadores y remodelación general de la matriz extracelular (ECM)1,2 . Después de la lesión, dicha reparación del tejido corneal da como resultado un tejido cicatricial opaco que reduce la transparencia corneal y ocluye el paso de la luz, distorsionando así la visión y, en los casos más graves, dando lugar a la ceguera corneal3. Por lo tanto, existe una clara necesidad de desarrollar modelos animales confiables para abordar las complejidades de la cicatrización de heridas e identificar los factores celulares y moleculares responsables del cierre de heridas y la regeneración de tejidos.

Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que examinan la cicatrización de heridas corneales han utilizado modelos postnatales4 o animales adultos 1,2,5,6,7. Si bien estos estudios han llevado a un avance significativo en la comprensión de la respuesta de curación de heridas corneales y los mecanismos subyacentes a la formación de cicatrices, los tejidos corneales dañados en estos modelos de curación no se regeneran por completo, lo que limita su utilidad para identificar los factores moleculares y los mecanismos celulares responsables de recapitular completamente la morfología y la estructura corneal después de la lesión. Por el contrario, las heridas fetales generadas con un cuchillo en la córnea embrionaria del pollito poseen una capacidad intrínseca para sanar completamente de una manera sin cicatrices8. En concreto, la córnea embrionaria del pollito exhibe regeneración no ficbrótica con la recapitulación completa de la estructura de la matriz extracelular y patrones de inervación 8,9.

El presente protocolo describe una secuencia de pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. En primer lugar, los óvulos se bloquean a edades embrionarias tempranas para facilitar el acceso al embrión. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones físicas in ovo a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea y se desea la herida. En tercer lugar, las incisiones lineales de la córnea central que penetran a través del epitelio corneal y en el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.

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Protocolo

La cepa de huevos utilizada en este protocolo fue White Leghorn, y todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Wesleyana de Illinois.

1. Incubación de huevos de pollitos

  1. Mantenga los huevos a ~ 10 ° C durante hasta 1 semana después de que se pongan para detener el desarrollo. Cuando esté listo para iniciar el desarrollo del embrión de pollito, limpie toda la cáscara del huevo con toallitas sin pelusa (consulte la Tabla de materiales) saturadas con agua a temperatura ambiente para eliminar la suciedad y los desechos.
  2. Asegúrese de que la cáscara del huevo esté desinfectada. Limpie toda la superficie del huevo con toallitas sin pelusa humedecidas con etanol al 70%. Limpie rápidamente el etanol para secar el huevo y evite la absorción de etanol a través de la cáscara del huevo hasta el embrión.
  3. Coloque los huevos horizontalmente en una bandeja. Marque la parte superior del óvulo para denotar la posición esperada del embrión. Incubar los huevos horizontalmente, con la función de balanceo activada, en una incubadora humidificada a 38 °C.

2. Ventanar los óvulos para prepararse para la disección de la membrana

  1. Retire los huevos de la incubadora al tercer día de desarrollo embrionario (E3). Esteriliza la parte superior de los huevos con toallitas sin pelusa humedecidas con etanol al 70%. Seque el etanol de las superficies de la cáscara del huevo.
    NOTA: Para garantizar que el desarrollo no se retrasara durante el procedimiento de ventana, se retiraron 6-12 huevos, y el procedimiento se llevó a cabo rápidamente en estos mientras que los huevos restantes se dejaron en la incubadora.
  2. Coloque un huevo horizontalmente en un soporte de huevo seguro (consulte la Tabla de materiales). Usando el extremo afilado de las tijeras de disección, cree un pequeño agujero en la parte superior de la cáscara del huevo cerca del extremo puntiagudo del huevo.
    NOTA: Este orificio facilitará la eliminación de la albúmina, que es necesaria para dejar caer la yema y el embrión lejos de la superficie interna de la cáscara del huevo. Para los titulares de huevos, se utilizaron pisos de relleno de huevos de pulpa de papel, dentro de los cuales se envían los huevos.
  3. A través del orificio (Paso 2.2.), inserte una aguja hipodérmica biselada de 18 G. Con la aguja empujada hacia la superficie interna inferior del huevo y el lado biselado de la aguja hacia el extremo puntiagudo del huevo (por ejemplo, lejos de la ubicación esperada de la yema y el embrión cerca de la mitad del huevo), retire 2-3 ml de albúmina del huevo de gallina y deséchelo.
    NOTA: Si la aguja corta el embrión o su vasculatura asociada durante este paso, dará como resultado que la sangre se aspire con la albúmina. Esto resultará en la muerte del embrión. Además, si la yema se aspira inadvertidamente junto con la albúmina durante este paso, el embrión no será viable. En cualquier caso, el óvulo debe descartarse si el embrión no puede utilizarse inmediatamente para otros fines.
  4. Limpie la superficie de la cáscara de huevo que rodea el orificio con toallitas sin pelusa ligeramente humedecidas con etanol al 70% y séquelas. Selle el orificio hecho para quitar la albúmina con cinta transparente.
  5. Con el extremo afilado de las tijeras de disección, haga un segundo orificio de "ventana" en la parte superior de la cáscara del huevo en el sitio de marcado (Paso 1.3.). Asegúrese de que las tijeras no se extiendan demasiado en la cáscara del huevo para evitar el contacto y el daño del embrión o la vasculatura embrionaria, que a menudo se colocarán dentro del huevo directamente debajo del sitio del segundo agujero.
  6. Usando pinzas de iris curvas, ensanche el orificio de la "ventana" para abarcar ~ 2-3 cm de diámetro y sirva como una "ventana" al embrión en desarrollo debajo de la cáscara.
    1. Inserte un extremo de los fórceps en el orificio, manteniéndolo paralelo y yuxtapuesto estrechamente con la cáscara del huevo. Con el extremo de las otras pinzas colocadas fuera de la cáscara del huevo, pellizque cuidadosamente los dos extremos de las pinzas juntas, lo que les permite romperse y eliminar pequeños trozos de la cáscara del huevo. Continúe rompiendo y eliminando los fragmentos de cáscara de huevo hasta que quede una ventana de 2-3 cm que se superponga directamente al embrión.
      NOTA: Huevos en los que los embriones no se encuentran directamente debajo del orificio realizado en el Paso 2.6. no debe utilizarse, ya que las próximas disecciones de membrana serían difíciles de completar. Incluso balanceando los óvulos horizontalmente, alrededor del 10% de los huevos son inutilizables debido al mal posicionamiento del embrión. Estos embriones se pueden utilizar para otros fines.
  7. Para limitar la contaminación bacteriana, agregue a través del orificio de la ventana (por ejemplo, en el huevo) ~ 100-200 μL de solución de Ringer (8 g de NaCl, 0.37 g de KCl y 0.23 g de CaCl2.2H 20 por L de H20 destilado) que contenga antibióticos de penicilina / estreptomicina (50 U / ml de penicilina y 50 μg / ml de estreptomicina, ver Tabla de Materiales).
  8. Selle el orificio de la ventana con cinta adhesiva transparente. Realice el sellado del huevo alineando una esquina de la cinta en el eje largo del orificio y presionando la cinta contra la cáscara ~ 1-2 cm de distancia del borde del agujero.
    1. Continúe sellando alrededor de la abertura hasta que quede una solapa colgante de cinta adhesiva en un lado. Presione los dos trozos de cinta juntos, creando una forma abovedada sobre el agujero, y presione la solapa de cinta colgante sobre la cáscara para terminar de sellar el huevo.
      NOTA: Los huevos deben ser ventanados en E2 o E3. Según la experiencia, las ventanas antes de E2 dan como resultado una baja viabilidad embrionaria. Además, por E4, el embrión y las membranas extraembrionarias se unen a la cáscara del huevo10, y cualquier intento de ventana en E4 o posterior a menudo resulta en daño embrionario o desgarro de los vasos sanguíneos extraembrionarios, con cualquiera de los eventos que conducen al resultado de la muerte embrionaria.
  9. Devuelva los huevos "con ventanas" a la incubadora para un mayor desarrollo. Asegúrese de mantener los huevos horizontales y apague la función de balanceo de la incubadora.
  10. Repita los pasos 2.2.-2.9. por cada huevo.

3. Microdisección de las membranas extraembrionarias

  1. Retire un huevo con ventana E5.5 de la incubadora. Exponga el embrión cortando la cinta lejos de la ventana con tijeras de disección esterilizadas.
  2. Use un microscopio de disección para observar el embrión y sus membranas extraembrionarias a través de la ventana. Si es necesario, use tijeras o pinzas de iris curvas para ensanchar la ventana de modo que el embrión esté bien posicionado debajo de la ventana, teniendo cuidado de no dañar la vasculatura embrionaria.
    1. Agregue dos gotas de la solución de Ringer que contengan antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
  3. Utilice un microscopio de disección para asegurarse de que el embrión se encuentra en la etapa de desarrollo adecuada (estadio 27 de Hamburger Hamilton, ~E5.5)11,12 y localice las posiciones de la membrana amniocoriónica (ACM) y la membrana corioalantoica (CAM).
    NOTA: En esta etapa, el embrión está rodeado por el ACM, que comprende la membrana amniótica y la membrana coriónica suprayacente fusionada y parcialmente cubierta por la alantois altamente vascularizada, que se extiende desde la región intestinal del embrión y se fusiona con el corion superpuesto para formar el CAM11,12. El ACM no está muy vascularizado, lo que permite diseccionar estas membranas para exponer el embrión sin dañar los vasos sanguíneos y dañar al embrión.
  4. Realizar disecciones de membrana extraembrionaria en esta etapa (E5.5).
    NOTA: E5.5 es el momento ideal para realizar las disecciones de membrana extraembrionaria. La disección de las membranas antes (por ejemplo, en E4) antes de la formación de CAM reduce la accesibilidad del embrión en etapas posteriores11. Además, en E5.5, el embrión solo está parcialmente cubierto por el CAM altamente vascularizado, sin embargo, durante los próximos 1-2 días, el CAM envuelve rápidamente e impide un mayor acceso al embrión 11,12. Por esta razón, la disección de membrana en E6 o posterior es un desafío a medida que aumenta el riesgo de desgarro de los vasos sanguíneos.
    1. Use un par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente el ACM y alejarlo del embrión. Luego use tijeras microdisecantes esterilizadas para cortar un agujero en el ACM directamente sobre la extremidad anterior que se extiende desde la membrana que recubre la extremidad anterior hasta la membrana que recubre la cabeza.
      NOTA: Este paso relaja las membranas coriónicas y amniónicas, lo que las hace más fáciles de agarrar y diseccionar aún más con fórceps en los siguientes pasos. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema útil de cómo se diseccionan las membranas a través de la ventana de la cáscara del huevo.
  5. Use dos pares de fórceps finas y estériles para agarrar suavemente el amnios en dos posiciones adyacentes entre el ACM y el CAM (por ejemplo, un área entre el corte hecho por encima de la extremidad anterior y el borde más cercano del CAM).
    1. Mueva cuidadosamente cada par de fórceps, ambos agarrando firmemente la membrana amniótica, lejos el uno del otro, con un par moviéndose dorsalmente hacia el embrión y el otro ventralmente.
      NOTA: Este movimiento sirve para desgarrar aún más el amnios al tiempo que separa el ACM (que es tirado en la dirección dorsal con respecto al embrión por un par de fórceps) y el CAM (que es tirado en la dirección ventral con respecto al embrión por el otro par de fórceps).
    2. Asegúrese de que las membranas estén separadas cuando el CAM ya no cubra el embrión y la arteria y vena alantoica, que emanan del intestino embrionario al CAM, son fácilmente evidentes.
  6. Use fórceps finos esterilizados para diseccionar y eliminar cualquier membrana amniónica restante que cubra el embrión. Se observa más comúnmente que el amnios restante cubrirá parcialmente la mitad caudal del embrión.
    1. Usando fórceps esterilizados, agarre el amnios cerca de la región craneal media del embrión y tire cuidadosamente del amnios en una dirección caudal con respecto al embrión hacia el CAM desplazado anteriormente. El embrión ahora estará completamente expuesto, y un mayor crecimiento del CAM ocurrirá principalmente lejos del embrión en desarrollo.
      NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener un esquema útil sobre cómo aparecerá el embrión expuesto después de la disección de la membrana. Además, consulte un informe publicado anteriormente11 para obtener diagramas esquemáticos útiles de los pasos 3.3.-3.6.
  7. Agregue unas gotas de la solución de Ringer que contiene antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
  8. Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente, como se describe en el paso 2.8. Devuelva el huevo a la incubadora para un mayor desarrollo, manteniendo el huevo horizontal y manteniendo inactivada la función de balanceo de la incubadora.
  9. Repita los pasos 3.1.-3.8. por cada huevo.
    NOTA: Las disecciones de membrana extraembrionaria en E5.5 descritas anteriormente permitirán el acceso al embrión a través de E7, que es cuando se puede realizar la herida 8,9. En E8, el crecimiento continuo del tejido CAM comienza a cubrir la región craneal del embrión, lo que impide un mayor acceso a la córnea. Si se desea llevar a cabo la herida en córneas E8-E9 más antiguas, es posible reposicionar el CAM en crecimiento ventralmente con respecto al embrión (Paso 3.10.). Si uno desea enrollar en E7, Paso 3.10. no es necesario realizarlo y se puede proceder al Paso 4, herida corneal.
  10. Retire un huevo E7 de la incubadora cuyas membranas extraembrionarias se diseccionaron previamente en E5.5 (Pasos 3.1.-3.8.). Agarre con fórceps esterilizados cualquier tejido de membrana amniónica disponible fusionado al CAM y tire suavemente de la membrana amniónica lejos de la región craneal del embrión en una dirección ventral con respecto al embrión.
    NOTA: Dado que la membrana amniónica que se desplaza lejos del embrión se fusiona con la CAM, la CAM en crecimiento y altamente vascularizada seguirá a las pinzas de agarre amniónico y se alejará de la región craneal. Repita este paso diariamente para desplazar continuamente el CAM lejos del embrión hasta que el embrión esté en la edad deseada para la herida.

4. Heridas en la córnea

  1. Obtenga un óvulo de la incubadora para herir a la edad embrionaria deseada, E7-E9. Exponga el embrión cortando la cinta lejos de la ventana con tijeras de disección esterilizadas. Agregue unas gotas de la solución de Ringer que contiene antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
  2. Use un cuchillo de microdisección para hacer una incisión que abarque la extensión de la córnea del ojo derecho (debido a cómo el embrión se pone en el óvulo, el ojo izquierdo no es accesible pero puede servir como un control no herido), que es paralelo y está en línea con la fisura coroidea (Figura 1). El primer corte atravesará el epitelio corneal.
    1. Use el cuchillo de microdisección para lacerar nuevamente la córnea en el mismo lugar que la primera incisión 2 veces más (por ejemplo, tres cortes en total, con corte 2 y corte 3 que ocurren junto con la misma posición en la córnea que el corte 1)11. La segunda laceración atravesará la membrana basal, y la tercera penetrará en el estroma anterior.
      NOTA: Si el embrión se ha asentado debajo de la CAM diseccionada, se pueden usar pinzas de iris curvas esterilizadas para mover cuidadosamente la cabeza fuera de debajo de la CAM. Coloque las pinzas de iris curvas debajo de la cabeza, haciendo contacto con el lado izquierdo de la cabeza. Acuna toda la cabeza sobre pinzas de iris curvas cerradas y levanta suavemente la cabeza alrededor y por encima del CAM. Para ayudar con la viabilidad, use una técnica similar con las pinzas de iris curvas para volver a meter el embrión debajo de la CAM después de la cirugía para promover el crecimiento adecuado de la CAM.
  3. Agregue 3-4 gotas de solución de Ringer que contengan antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
  4. Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente y vuelva a la incubadora, dejando el huevo horizontal. Permita que el embrión se desarrolle y que la herida corneal sane durante el período deseado (por ejemplo, 0.5-11 días), y luego eutanasia humanamente al embrión por decapitación.
  5. Use fórceps de iris curvos para cosechar el ojo de un embrión sacrificado que flota en una placa de Petri de la solución salina de Ringer agarrando suavemente el ojo en su lado posterior, donde el ojo y el tejido facial se encuentran, y levantando cuidadosamente todo el ojo lejos y libre del tejido facial.
    1. Use fórceps finos para hacer un pequeño orificio (3-5 cm) en la parte posterior de todo el ojo y fije todo el ojo en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche con agitación leve.

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Resultados

Después de la disección anterior de la ACM y CAM en E5.5 para exponer la región craneal del embrión en desarrollo, se realizó una serie de laceraciones que abarcaron la córnea central E7 en ovo (Figura 1). Una herida ideal para estudiar la regeneración de la córnea se produce después de tres laceraciones, cada una hecha en la misma ubicación de la córnea. La primera laceración atraviesa el epitelio corneal, mientras que la segunda y tercera laceraciones penetran en la membrana basal...

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Discusión

El pollito es un sistema modelo ideal para estudiar la reparación de la herida de la córnea fetal sin cicatrices. A diferencia de los mamíferos, el polluelo es fácilmente accesible durante todo el desarrollo utilizando las estrategias in ovo8 o ex ovo 24. La córnea embrionaria del pollito es mucho más grande que las córneas de los roedores, con casi el 50% del volumen craneal dedicado al ojo25, lo que la hace altamente susceptible a...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos con respecto a la información presentada en este manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de Desarrollo Artístico y Académico a través de Illinois Wesleyan University a TS y financiado en parte por NIH-R01EY022158 (PL).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja hipodérmica de 18 gFisher Scientific14-826-5D
Cuchillo de microdisección en ángulo de 30 gradosFine Science Tools10056-12
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sondas molecularesD1306
jeringa de 5 mLFisher Scientific14-829-45
Alexa Anticuerpossecundarios marcados con flúorSondas moleculares
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2-H20)SigmaC8106
Bandejas de huevos de gallinaGQFO246
Pinzas de disección, punta fina, dentadasVWR82027-408
Tijeras de disección, punta afiladaVWR82027-578
Iris 1 x 2 Dientes Tejido Pinzas totalmente curvadasVWR100494-908
KimwipesSigma Z188956
tijeras de microdisecciónVWR470315-228
Antifibronectina (IgG1) para ratonesHybridomaB3/D6Hybridoma
(IgG1) para ratonesHybridoma Bank 3H11
Antineurona específica de ratón β-tubulina (Tuj1, IgG2a)Biolegend801213
Anti-tenascina de ratón (IgG1)Estudios del desarrollo Banco de hibridomasM1-B4
ParaformaldehídoSigma158127
Penicilina/estreptomicinaSigmaP4333
Cloruro de potasio (KCl)SigmaP5405
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificBP358
Sportsman 1502 incubadora de huevosGQF1502
Empaque a mano (1,88 pulgadas de ancho)Escocésn/a
Bank Bank

Referencias

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