Un método libre de llama para esterilizar púas, espátulas y bisturíes de C. elegans

Resumen

Este artículo describe un método para esterilizar picos de gusanos, espátulas y bisturíes utilizando un microincinerador en lugar de una llama abierta.

Resumen

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) es un organismo modelo óptimo para la investigación y la educación en instituciones principalmente de pregrado. Los estudiantes universitarios pueden aprender rápidamente la técnica estéril requerida para mantener los cultivos de C. elegans . La esterilización de los picos de platino utilizados para transferir gusanos de una placa a otra se realiza tradicionalmente manteniendo la púa en una llama de un quemador Bunsen o una linterna de etanol. Sin embargo, los quemadores Bunsen requieren una fuente de gas, y ambos equipos representan el riesgo de incendio accidental asociado con una llama abierta. Aquí se demuestra una técnica para esterilizar picos de gusanos, espátulas y bisturíes utilizando un microincinerador de bucle bacteriológico infrarrojo. Este equipo requiere solo una toma de corriente eléctrica y minimiza los posibles riesgos de incendio. Al reducir el riesgo y los requisitos de gas, esta técnica es muy adecuada para la investigación y la enseñanza en un entorno de pregrado.

Introducción

El organismo modelo C. elegans es muy adecuado tanto para la investigación como para la educación en instituciones principalmente de pregrado (PUI) debido al bajo costo, la facilidad de mantenimiento y la gama de aplicaciones 1,2,3,4. Para manejar gusanos, por ejemplo, para mover un gusano de una placa a otra, los experimentadores pueden usar una selección de gusanos. Se puede hacer o comprar una variedad de selecciones para su uso con C. elegans. Las púas se hacen más comúnmente con una punta de platino o platino / iridio, montada en un mango de vidrio, metal o madera. Los mangos de vidrio se pueden hacer internamente derritiendo una pipeta Pasteur alrededor de un alambre de platino hasta que el cable esté seguro. Se puede encontrar información adicional sobre la cría de C. elegans, incluida la forma de cultivar y mantener gusanos y sus fuentes de alimentos, en WormBook⁵ y otras fuentes ^6,7,8.

Cuando se trabaja con C. elegans, las técnicas asépticas se utilizan típicamente para prevenir la contaminación con microbios y hongos. Ejemplos de técnicas asépticas incluyen la esterilización de instrumentos, el autoclave de reactivos y la realización de trabajos en campos estériles. Las púas de gusanos generalmente se esterilizan con una llama abierta⁹. Además, la esterilización del gusano incinera los gusanos, evitando así confusiones accidentales de cepas cuando se trabaja con múltiples cepas de gusanos. Los métodos típicos para esterilizar las púas de gusanos implican una llama abierta de un quemador Bunsen, una linterna de etanol o un encendedor estándar (Tabla 1). Nos motivaron a buscar alternativas más seguras a los métodos existentes en el laboratorio cuando un estudiante de pregrado, sin saberlo, derramó etanol mientras llenaba una linterna de etanol y accidentalmente inició un pequeño incendio al encender la linterna. Desafortunadamente, se han reportado muchos accidentes usando linternas de etanol 10,11,12. Afortunadamente, los métodos alternativos de esterilización han sido validados para su uso en microbiología, y el propósito de este artículo es demostrar cómo usar este equipo para esterilizar instrumentos para su uso con C. elegans.

En los laboratorios de microbiología, la técnica aséptica también es crítica. Los bucles serológicos y los alambres de platino se esterilizan utilizando una llama abierta¹³ o un microincinerador 14,15,16. Otros nombres para micro-incineradores incluyen micro-esterilizadores o bacto-incineradores. Las ventajas del microincinerador sobre los métodos tradicionales de llama incluyen la reducción del riesgo de incendio, la eliminación de salpicaduras de materiales incinerados y la capacidad de trabajar en una campana de flujo laminar / gabinete de bioseguridad 16,17,18. De hecho, tanto la Sociedad Americana de Microbiología como la Organización Mundial de la Salud recomiendan el uso de microincinerales sobre el uso de una llama abierta 17,19,20. En comparación con los quemadores Bunsen, los microincineradores tampoco requieren una línea de gas, que algunos laboratorios podrían no tener, o podrían no haber ubicado en cada banco para que los estudiantes la usen. Inspirado por estas ventajas, se desarrolló un protocolo para reemplazar el uso de llama con microincinerales para la esterilización de instrumentos de uso común como picos, espátulas y bisturíes en el laboratorio de C. elegans. Este método puede ser apropiado para instructores e investigadores que buscan mejorar la seguridad y / o flexibilidad cuando trabajan con C. elegans.

Protocolo

1. Preparar el microincinerador

1. Conecte una guía de accesorios de soporte de bucle al microincinerador enganchándola en el cañón exterior.
2. Conecte el microincinerador a una toma de corriente estándar de 120 V o 230 V, según corresponda.
   NOTA: Esto se puede hacer en una mesa de trabajo o en una campana de flujo laminar.
3. Gire el microincinerador al ajuste alto y deje que se caliente durante 10-20 minutos dependiendo de las instrucciones del fabricante para alcanzar una temperatura óptima de 800-825 ^oC.
   NOTA: Si mantiene el incinerador encendido durante más de 3 h, el ajuste de temperatura más baja (500 ^oC) se puede utilizar como ajuste de espera. De acuerdo con los manuales de usuario de los fabricantes, esto extiende la vida útil del equipo.

2. Esteriliza el pico, la espátula o el bisturí

1. Inserte el instrumento en el área de esterilización cilíndrica sin tocar los lados deslizándose a lo largo de la guía²¹.
   NOTA: Si esteriliza un bisturí, es fundamental evitar tocar la pared de cerámica con la cuchilla. Raspar la pared de cerámica puede comprometer la integridad de la unidad de calefacción.
2. Sostenga el instrumento en el área de esterilización durante 5-7 s.
3. Retire el instrumento sin tocar los lados deslizándose hacia atrás a lo largo de la guía.
4. Para las púas, deje que el instrumento se enfríe durante 3-5 s antes de tocar un gusano para evitar quemarlo.
   NOTA: Los bisturíes o espátulas que no se dejan enfriar cantarán el agar.
5. Después de recoger los gusanos, vuelva a insertar el pico en la cámara durante 5-7 s para incinerar cualquier gusano en el pico.

3. Método comparativo - esterilización de instrumentos utilizando un quemador Bunsen

1. Conecte el quemador Bunsen a la línea de gas mediante tubos de goma. Asegúrese de asegurar el tubo herméticamente y coloque el quemador lejos de los objetos superiores.
2. Encienda el gas girando la perilla de la línea de gas.
3. Encienda el quemador con un delantero o encendedor.
4. Ajuste la llama usando la perilla de gas y la entrada de aire hasta que se vea un cono azul.
5. Sostenga el pico, la espátula o el bisturí en la llama hasta que brille en rojo.
6. Para las púas, deje que el instrumento se enfríe durante 3-5 segundos antes de tocar un gusano para evitar quemarlo.
   NOTA: Los bisturíes o espátulas que no se dejan enfriar cantarán el agar.
7. Después de recoger los gusanos, vuelva a insertar el pico en la llama para incinerar cualquier gusano en el pico.

4. Experimenta

1. Cultivo OP50 Bacterias Escherichia coli (E. coli) en Caldo Luria²² durante la noche en un agitador de 37 ^oC.
2. Después del cultivo nocturno, diluya el cultivo en agua estéril en una proporción de 1:100.
   NOTA: Este factor de dilución fue elegido para asegurar la separación de las colonias después del emplatado.
3. Sumerja un pico de gusano esterilizado con un quemador Bunsen en la solución bacteriana, vuelva a esterilizar con el quemador Bunsen y agítelo en 100 ml de agua estéril.
4. Coloque los 100 μL de agua en una placa de Petri de^{agar LB 22,23 de} 10 cm, extienda el agua con un esparcidor de células estériles e incube a temperatura ambiente durante 24 h con la tapa puesta.
5. Realice los pasos 4.3-4.4 utilizando un pico de gusano esterilizado con un microincinerador.
6. Como control positivo, realice los pasos 4.3-4.4 sin volver a esterilizar.
7. Como control negativo, realice los pasos 4.3-4.4 utilizando agua estéril en lugar de la solución bacteriana.
8. Cuente las colonias manualmente después del período de incubación.

Resultados

Se ideó un experimento simple (sección 4) para demostrar las tasas de contaminación relativas utilizando un microincinerador frente a una llama (Figura 1, Tabla 2). Si bien estos resultados representan tasas de contaminación en todos los métodos, no sería necesario repetir este método para utilizar la técnica del microincinerador. El experimento se llevó a cabo por triplicado. El control negativo fue agua estéril sin bacterias. El control positivo no utilizó ninguna técnica de esterilización: el pico se sumergió en el cultivo OP50 diluido y luego se transfirió directamente al agua estéril. Todas las réplicas y condiciones se ejecutaron en paralelo el mismo día. En las tres placas de control negativas, se contaron cero colonias. Se obtuvo un recuento medio de 4,7 (± 0,3 SEM) colonias cuando se utilizó el quemador Bunsen para esterilizar los picos. Se observó un recuento medio de 3,3 colonias (±1,2 SEM) en la condición de microincinerador. Sin embargo, se obtuvo un recuento medio de 298,3 colonias (±17,9 SEM) en la condición de control positivo. Una prueba t de 2 colas asumiendo una varianza igual comparando el quemador Bunsen con el microincinerador no arrojó diferencias estadísticamente significativas, p = 0,35. Por lo tanto, el microincinerador logró resultados de esterilidad igualmente efectivos que el quemador Bunsen.

Figura 1: Recuentos bacterianos en todos los métodos de esterilización. Las púas se sumergieron en cultivo 1:100 OP50 en agua estéril y luego se esterilizaron con un quemador Bunsen o un microincinerador. Las púas se sumergieron en agua estéril, se enchaparon en agar LB^22,23 y se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente, y las colonias se contaron manualmente. El control positivo no tuvo esterilización, y el control negativo utilizó agua estéril sin bacterias. n = 3 réplicas por condición. Nota: el eje y se rompe para permitir la separación de puntos de datos en partes relevantes del gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Método de esterilización	Costar	Requisitos del laboratorio	Ventajas		Desventajas
Microincinerador	US$ 365–530	Toma de corriente de 120 V o 230 V	• Portátil • Sin llama abierta ni elemento calefactor expuesto • Utilizable en campanas de flujo laminar y gabinetes de seguridad biológica		• Tiempo de calentamiento • Mayor costo
Quemador Bunsen	US$ 24–169	Línea de gas	• Configuración rápida • Bajo costo		• Llama abierta • No se recomienda su uso en campana de flujo laminar o gabinete de seguridad biológica
Lámpara de etanol	US$ 11	Ninguno	• Configuración rápida • Bajo costo • Recargable		• Llama abierta • Peligro de seguridad al rellenar • No se recomienda su uso en campana de flujo laminar o gabinete de seguridad biológica • No permitido en ciertas instituciones
Encendedor	$5–8	Ninguno	• Bajo costo • Accesible • Desechable • Recargable		• Llama abierta • Operado a mano • No se recomienda su uso en campana de flujo laminar o gabinete de seguridad biológica

Tabla 1: Comparación de métodos para esterilizar instrumentos. Se compararon cuatro métodos para esterilizar instrumentos en función de las ventajas, desventajas, costos y requisitos de laboratorio.

Replicar	Condición
	Microincinerador	Quemador Bunsen	Control negativo	Positve Control
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
Significar	3.3	4.7	0.0	298.3
SEM	1.2	0.3	0.0	17.9

Tabla 2: Datos brutos de recuentos bacterianos en todos los métodos de esterilización. Las púas se sumergieron en cultivo 1:100 OP50 en agua estéril y luego se esterilizaron con un quemador Bunsen o un microincinerador. Las púas se sumergieron en agua estéril, se enchaparon en agar LB^22,23 y se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente, y las colonias se contaron manualmente. El control positivo no tuvo esterilización, y el control negativo utilizó agua estéril sin bacterias. n = 3 réplicas por condición. La media y el SEM se informaron por debajo de los recuentos individuales.

Discusión

C. elegans es un organismo modelo muy adecuado para ejercicios en laboratorios de enseñanza de pregrado. El uso de microincineradores en lugar de llamas abiertas proporciona beneficios tanto en los laboratorios de investigación como en los laboratorios de aula. De hecho, los cursos de laboratorio de pregrado pueden representar un mayor riesgo de incendios accidentales dado el número de científicos recién capacitados en la sala. Además, el riesgo de incendio aumenta cuando se usa etanol para esterilizar instrumentos cerca de la fuente de llama, ya que los vapores de etanol son inflamables. La portabilidad también confiere una ventaja para las aulas donde no se instalan líneas de gas en cada banco. Este método se ha empleado en laboratorios de docencia e investigación de nuestra institución, resultando en ningún aumento de la contaminación y cero accidentes de seguridad de laboratorio desde su incorporación en 2016.

Para garantizar la compatibilidad con los microincineradores, se probó una gama de púas con diferentes montajes, composiciones de cables y medidores de cables. La composición del alambre incluía 100% de platino, así como 90% de platino / 10% de iridio con un espesor de alambre de 30-32 G, e independientemente del grosor y la composición, el método de calentamiento no comprometió la integridad del cable. Los montajes incluían dos tipos diferentes de asas de pico disponibles comercialmente y montajes de vidrio hechos internamente de pipetas Pasteur. Tenga en cuenta que las púas no brillan al rojo vivo como lo hacen en la llama. Sin embargo, todavía se logra una esterilización suficiente siempre que el esterilizador haya alcanzado la temperatura adecuada. Por lo tanto, es fundamental permitir que el microincinerador se caliente durante 10 o 20 minutos, como se indica en las instrucciones del fabricante. Mantener el instrumento en la cámara durante al menos 5 s para lograr la esterilización también es crítico. Dejar el instrumento en la cámara por más de 7 s no causará daño al instrumento, pero es innecesario. Si bien este es un procedimiento relativamente sencillo con pasos mínimos y es poco probable que necesite solución de problemas, puede tomar algo de práctica aprender a estabilizar el instrumento en el cañón sin tocar los lados.

Para reemplazar una llama abierta, un método de esterilización debe cubrir todas las aplicaciones utilizadas en un laboratorio. Además de esterilizar instrumentos, los laboratorios de C. elegans también pueden utilizar quemadores Bunsen para crear un campo estéril para realizar otras tareas como verter placas o inocular cultivos¹³. Sin embargo, si esto crea un campo estéril o atrae contaminantes aún viables sigue siendo controvertido¹⁴. Aunque no es una opción en todas las instituciones, se puede utilizar un gabinete de bioseguridad o una campana de flujo laminar para estos fines, lo que permite que un laboratorio funcione sin el uso de llamas abiertas. Los manuales de instrucciones para la mayoría de los microincineradores recomiendan no usar para la esterilización de cuchillas de bisturí porque el raspado de las paredes internas daña el esterilizador. Sin embargo, si se usa cuidadosamente una guía, se puede esterilizar una cuchilla de bisturí o espátula sin tocar las paredes internas. Esto extiende el uso de la técnica para permitir el chunking sin usar una llama y permite que un laboratorio de C. elegans funcione sin cambiar las técnicas entre esterilizar diferentes objetos.

Como se describe en la Tabla 1, los microincineradores ofrecen una mayor seguridad, una mayor compatibilidad con las campanas de flujo laminar y una mayor portabilidad sobre los métodos basados en llamas, pero tienen limitaciones. Son más costosos que los otros métodos y requieren un tiempo de calentamiento antes de que se alcancen las temperaturas de esterilización. En conclusión, este método, que se utiliza habitualmente en muchos laboratorios de microbiología, puede ser aplicable en algunos laboratorios de investigación y enseñanza de C. elegans que buscan mejorar la seguridad del laboratorio sin comprometer la esterilidad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alambre 90% platino 10% iridio	Tritech	PT-9010	Se pueden utilizar otras fuentes y composiciones de alambre.
Agarosa	Sigma Aldrich	A6013	LB ingrediente de agar
Quemador Bunsen	Fisher Scientific	50-110-1225	Se pueden utilizar otros quemadores Bunsen
Lámpara de etanol	Carolina 706604		Se incluye aquí como referencia a la Tabla 1
Encendedor	Carolina	706636	Se incluye aquí como referencia a la Tabla 1
Accesorio de soporte de bucle	Fisher	22-630-002	Referido en el manuscrito como "guía"
Microincinerador	Thomas Scientific	1154J15	Hay muchas empresas que venden equipos similares. Modelos similares también vendidos por Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400) y BT Lab Systems (BT1702).
Gusanos N2	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB ingrediente
OP50 E. coli	CGC	OP50
Placa de Petri	Fisher	08-772B
Mango de ganzúa	Tritech	TWPH1
Hoja de bisturí	Fisher	12-000-161
Mango de bisturí	Fisher	12-000-164
Espátula	Fisher	14-374	Otras espátulas funcionarán
Esparcidores de células estériles	VWR	76206-438	Se pueden utilizar otros esparcidores de células siempre que sean estériles
Ingrediente de triptona	Sigma Aldrich	T7293	LB
Extracto de levadura	Sigma Aldrich	Y1625	LB ingrediente