Cicatrización de heridas corneales de pez cebra: de la abrasión al análisis de imágenes de cierre de heridas

Resumen

Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.

Resumen

Como la superficie transparente del ojo, la córnea es fundamental para una visión clara. Debido a su ubicación, este tejido es propenso a los insultos ambientales. De hecho, las lesiones oculares que se encuentran clínicamente con mayor frecuencia son las de la córnea. Si bien la cicatrización de heridas corneales se ha estudiado ampliamente en pequeños mamíferos (es decir, ratones, ratas y conejos), los estudios de fisiología corneal han descuidado otras especies, incluido el pez cebra, a pesar de que el pez cebra es un modelo de investigación clásico.

Este informe describe un método para realizar una abrasión corneal en el pez cebra. La herida se realiza in vivo en peces anestesiados utilizando una rebaba ocular. Este método permite una herida epitelial reproducible, dejando el resto del ojo intacto. Después de la abrasión, el cierre de la herida se controla en el transcurso de 3 h, después de lo cual la herida se reepiteliza. Mediante el uso de microscopía electrónica de barrido, seguida de procesamiento de imágenes, se puede investigar la forma de la célula epitelial y las protuberancias apicales para estudiar los diversos pasos durante el cierre de la herida epitelial corneal.

Las características del modelo de pez cebra permiten estudiar la fisiología del tejido epitelial y el comportamiento colectivo de las células epiteliales cuando el tejido es desafiado. Además, el uso de un modelo privado de la influencia de la película lagrimal puede producir nuevas respuestas con respecto a la respuesta corneal al estrés. Finalmente, este modelo también permite la delineación de los eventos celulares y moleculares involucrados en cualquier tejido epitelial sometido a una herida física. Este método se puede aplicar a la evaluación de la eficacia del fármaco en las pruebas preclínicas.

Introducción

Como la mayoría de los epitelios están en contacto con el entorno externo, son propensos a lesiones físicas, lo que los hace muy adecuados para el estudio de los procesos de curación de heridas. Entre los tejidos bien estudiados, la córnea es un modelo extremadamente útil en la investigación de los aspectos celulares y moleculares de la cicatrización de heridas. Como superficie externa transparente, proporciona protección física al ojo y es el primer elemento para enfocar la luz en la retina. Si bien la estructura y la composición celular de la retina difieren entre las especies¹, estos elementos de la córnea son generalmente similares en todos....

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la junta nacional de experimentación con animales.

1. Preparativos

1. Prepare la solución madre de tricaína utilizada para la anestesia^{con 26} de anticipación (solución madre al 0,4% utilizada en este protocolo). Use guantes y mantenga los materiales en una campana de humos siempre que sea posible.
   1. Para 50 ml de una solución al 0,4%, pesar 200 mg de polvo de tricaína en un tubo de 50 ml. Disolver el polvo en aproximadamente 45 ml de agua de doble destilación.
   2. Ajuste el pH de la solución madre de tricaína a 7 con 1 M Tris (pH 8.8, ~ ....

Resultados

Este estudio describe un método que utiliza una rebaba oftálmica en experimentos de curación de heridas corneales de pez cebra. El método se modifica a partir de estudios previos en ratones, donde se demostró que la rebaba elimina las capas de células epiteliales de manera eficiente¹³. Los desafíos en la herida corneal del pez cebra incluyen el tamaño relativamente pequeño del ojo y, en el caso de experimentos que consumen mucho tiempo, la necesidad de mantener un flujo constante de agua a través .......

Discusión

Las lesiones físicas corneales son la causa más común de visitas de pacientes oftalmológicos al hospital. Por lo tanto, es importante establecer modelos relevantes para el estudio de diferentes aspectos de la fisiopatología corneal. Hasta ahora, el ratón es el modelo más utilizado para el estudio de la cicatrización de heridas corneales. Sin embargo, agregar gotas para los ojos en los ojos heridos murinos para validar el impacto de medicamentos específicos en la cicatrización de heridas corneales puede ser difícil. En es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,1M Na-PO4 (tampón de fosfato de sodio), pH 7,4	interno		La solución se prepara a partir de un tampón de fosfato de sodio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado a pH 7,4 con 1M NaH2 PO4 ).
0,2 M Na-PO4 (tampón de fosfato de sodio), pH 7,4	La solución interna		se prepara a partir de un tampón de fosfato de sodio 1M (1M Na2 HPO4 ajustado a pH 7,4 con 1M NaH2 PO4 ).
Puntas de rebaba de 0,5 mm	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8,8
Agar Scientific	G3347N		Rebaba
Algerbrush, Instrumento completo	Alger Equipment Company	BR2-5
Intercambios de algodón	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Placa	de disecciónHerramientas de
Fine	Science Tools
agua bidestilada	interna Tubos Eppedorf
2 ml	cualquier proveedor
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato	Sigma	A5040	Precaución: causa irritación.
Glutaraldehído, solución acuosa al 50%, grado I	Sigma	G7651	Precaución: tóxico.
Clorhidrato de lidocaína	Sigma	L5647	Precaución: tóxico.
monturas	Agar Scientific	G301P
Placa de Petri	Thermo Scientific	101VR20
Tiras indicadoras de pH	Macherey-Nagel	92110
Cucharas de plástico	cualquier proveedor
Tubos de plástico, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Tubos de plástico, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Microscopio electrónico de barrido	FEI	Quanta 250 FEG
Esponja blanda	cualquier proveedor
Barnizadora de pulverización catódica	Quorum Technologies	GQ150TS
Microscopio estereoscópico	Leica

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