Análisis de la dinámica de la microbiota fecal en ratones propensos al lupus utilizando un método de aislamiento de ADN simple y rentable

Los seres humanos y las bacterias han coexistido durante mucho tiempo. Han establecido una relación codependiente con efectos beneficiosos mutuos que influye en las respuestas inmunes del huésped de manera cuantitativa y cualitativa¹. Estudios recientes sugieren una asociación entre la composición de la microbiota intestinal y la patogénesis de enfermedades autoinmunes que incluyen la esclerosis múltiple 2, la artritis reumatoide³, la diabetes tipo^{2 4}, la enfermedad inflamatoria intestinal⁵ y el lupus eritematoso sistémico (LES)⁶. Sin embargo, aún no está claro si la microbiota intestinal es la causa principal o un efecto secundario de estas enfermedades autoinmunes⁷. Potencialmente, la microbiota intestinal podría exacerbar la enfermedad durante la fase efectora de los trastornos autoinmunes o desempeñar un papel en la regulación de la inducción de estas enfermedades⁸.

Se ha descrito disbiosis intestinal en ratones hembra propensos al lupus MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr), y se observaron cambios en la microbiota intestinal con un agotamiento significativo de los lactobacilos⁹. Cuando se administró por vía oral una mezcla de cinco cepas de Lactobacillus, los síntomas similares al lupus se atenuaron en gran medida en estos ratones, lo que sugiere un papel esencial de la microbiota en la regulación de la patogénesis del LES.

La siguiente técnica de extracción de ADN permite seguir las fluctuaciones de la microbiota y analizarlas cualitativa y cuantitativamente durante el curso de la enfermedad murina similar al LES en ratones propensos al lupus. Ya sea para examinar la microbiota intestinal sana o definir la disbiosis, es importante examinar críticamente cómo se recopilan los datos y si son precisos y reproducibles¹⁰. Cada paso es crítico en este proceso. Se debe utilizar una metodología adecuada para extraer ADN microbiano, ya que cualquier posible problema que introduzca sesgos durante el proceso de extracción de ADN podría resultar en una representación microbiana inexacta. Si bien el método fenol-cloroformo se describe aquí, existen kits disponibles comercialmente para extraer ADN de bacterias que funcionan bien en casos particulares¹¹. Sin embargo, su usabilidad está limitada por el costo y la cantidad de muestra requerida.

El protocolo presentado aquí es rentable y requiere solo una pequeña cantidad de muestra. Funciona bien con cualquier tipo de muestra de heces y es útil para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal a lo largo del tiempo, así como las comparaciones entre grupos. El ADN se aísla con un método de purificación de alcohol, que utiliza fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. La extracción a base de alcohol ayuda a limpiar y eliminar la muestra de proteínas y lípidos, donde el ADN se precipita en el paso final. El método propuesto tiene una eficiencia y calidad significativamente altas y ha demostrado ser preciso en la identificación de poblaciones bacterianas. Una nota crítica durante el procedimiento es que la contaminación del ADN puede ocurrir, y por lo tanto se requiere un manejo adecuado de la muestra¹².

Luego, el ADN es analizado por las plataformas de secuenciación de próxima generación para el gen 16S rRNA, como el Illumina MiSeq. En particular, la región hipervariable V4 se analiza para proporcionar una mejor cuantificación de los taxones de alto rango¹³. El análisis bioinformático posterior se subcontrata, seguido de un análisis interno utilizando métodos estadísticos estándar. Existen numerosos programas de software bioinformático de código abierto disponibles para la secuenciación posterior, y el tipo de análisis realizados depende en gran medida de la cuestión biológica específica de interés¹⁴. Este protocolo se centra específicamente en los pasos experimentales previos a la secuenciación y proporciona un método más versátil, rentable, comparable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales.

El locus Cx3cr1 gfp/gfp de ratones B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J se cruzó con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) durante 10 generaciones para generar ratones MRL/^lpr-CX ₃ CR1 gfp^/gfp. El cribado del genoma utilizando paneles de polimorfismo de nucleótido único (SNP) confirmó que el fondo genético de los ratones recién generados era más del 97% idéntico al de MRL / lpr. Después de eso, los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo los requisitos específicos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Las muestras se recolectaron cuando los ratones tenían 13, 14 y 15 semanas de edad.

1. Recogida de muestras de microbiota de ratones

1. Saque cada ratón individualmente de su jaula. Recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a -80 °C hasta que se procese. Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios.
   NOTA: Se puede usar un recipiente (por ejemplo, un vaso de precipitados) para colocar el mouse mientras espera la muestra fecal. Limpie el recipiente con etanol antes y después de cada ratón.
2. Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de 2 ml previamente pesado. Registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02-0.05 g por pellet fecal.
3. Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0,1 mm, 500 μL de tampón de lisis (50 mM de NaCl, 5 mM Tris y 50 mM de EDTA) y 200 μL de 20% de SDS.
4. Batir el tubo durante 4 minutos en un homogeneizador (a máxima potencia), seguido de 3-5 minutos de vórtice.
5. Gire durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma (presione el botón de la centrífuga hasta que alcance 1,000-1,200 x g, y luego suéltelo).

2. Extracción de ADN

1. Transfiera 350 μL de sobrenadante obtenido en el paso 1.5 (asegurándose de no transportar residuos) a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 ml. Añadir 500 μL de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI; 25:24:1, v/v) y vórtice durante 1 min.
   NOTA: A partir de ahora, las muestras deben manipularse dentro de una campana química. La PCI es tóxica.
2. Girar a 6.000 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo de tapa de presión de 1,5 ml. Añadir 180 μL (1:1) de cloroformo, invertir y mezclar.
   NOTA: Minimice la contaminación de la capa inferior al transferir la capa superior.
3. Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión.
   NOTA: Después de desechar PCI y cloroformo, los siguientes pasos se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica.
4. Agregue 180 μL de isopropanol frío y 36 μL de 5M NH₄Ac. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 min.
5. Girar a 18.400 x g durante 20 min a 4 °C. Vierta para desechar el sobrenadante. Lave el pellet varias veces con 500 μL de etanol frío al 70% mientras invierte.
   NOTA: El etanol debe diluirse con agua estéril doblemente desionizada.
6. Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante para eliminar el etanol residual.
7. Seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se vuelva transparente. Suspender el pellet en 50 μL de agua de grado molecular. Calentar el líquido a 37 °C durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos grandes de ADN.
8. Girar los tubos después del calentamiento para recuperar las gotas de condensación en la tapa (3.400 x g durante 1 min).
9. Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Use agua de grado molecular como un espacio en blanco. El ADN de buena calidad debe tener proporciones 260/280 que oscilan entre 1,8 y 2.
   NOTA: El rendimiento esperado de ADN es de al menos 0,03 g por pellet fecal.

3. Preparación de la muestra para la secuenciación del gen 16S rRNA

1. Envíe las muestras de ADN al Laboratorio Nacional de Argonne, donde se someten a la preparación de la biblioteca y se secuencian en el Illumina Miseq.
   1. Envíe las muestras en placas de 96 pocillos completamente faldadas, con muestras dispuestas en filas (A1-A12, B1-B12, etc.) y selladas con sellos de placa de aluminio.
   2. Enviar un volumen final de 20 μL por muestra por pocillo, con una concentración de 1 a 50 ng/μL.
      NOTA: Las diluciones deben hacerse con agua de grado molecular.
   3. Después de preparar las muestras, hilar a 600 x g durante 1 min a temperatura ambiente antes de congelar las muestras a -80 °C durante 24 h.
   4. Enviar durante la noche en hielo seco.

Los resultados del Laboratorio Nacional de Argonne son analizados por un bioinformático calificado, seguido de un análisis interno de los datos utilizando métodos estadísticos estándar. Los análisis típicos del microbioma implican la agrupación de secuencias similares en unidades taxonómicas operativas (OTU) o variantes de secuencia de amplicón (ASV) como un proxy para diferentes microorganismos en una muestra. Los recuentos de OTU o ASV en todas las muestras se pueden usar para verificar los cambios en la diversidad dentro de la muestra (alfa) y la diversidad entre muestras (beta). También se pueden usar para probar taxones que son diferencialmente abundantes en todas las categorías de metadatos de interés.

Como se muestra en la Figura 1, la cepa de ratón que carece del receptor CX3CR1 tiene una composición de microbiota intestinal diferente. En comparación con los ratones LMR/lpr de tipo salvaje, los ratones LMR/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp (que expresan la proteína verde fluorescente enlugar de CX3CR1) muestran diferencias significativas en ciertos géneros relevantes para bacterias potencialmente patógenas como las del filo Proteobacteria. Además, se observaron algunas diferencias para las bacterias comensales "sanas" como Bifidobacterium, pero no Lactobacillus.

Figura 1: Comparaciones de la microbiota intestinal a nivel de género para ratones MRL/lpr y MRL/lpr-CX3CR1. La abundancia de diferentes géneros a las 13, 14 y 15 semanas de edad (n = 5 ratones hembra por grupo). Se realizó ANOVA bidireccional. Sin significancia ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.