El presente protocolo describe un ensayo para evaluar la capacidad de oxidación de ácidos grasos en cultivos de células óseas primarias o líneas celulares relevantes.
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Artículo de método
El presente protocolo describe un ensayo para evaluar la capacidad de oxidación de ácidos grasos en cultivos de células óseas primarias o líneas celulares relevantes.
Se espera que la formación ósea mediante la diferenciación de osteoblastos requiera un aporte energético significativo, ya que estas células especializadas deben sintetizar grandes proteínas de la matriz extracelular que componen el tejido óseo y luego concentrar los iones necesarios para su mineralización. Los datos sobre los requisitos metabólicos de la formación ósea están surgiendo rápidamente. Si bien aún queda mucho por aprender, se espera que los trastornos en el metabolismo intermediario contribuyan a la enfermedad esquelética. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la capacidad de las células osteoblásticas para oxidar 14ácidos grasos marcados con C a 14CO2 y metabolitos solubles en ácido. Los ácidos grasos representan una reserva de energía rica que puede ser absorbida de la circulación después de la alimentación o después de su liberación de las reservas de tejido adiposo. El ensayo, realizado en matraces de cultivo de tejidos T-25, es útil para el estudio de la ganancia o pérdida de función de genes en la utilización de ácidos grasos y el efecto de las señales anabólicas en forma de factores de crecimiento o morfógenos necesarios para el mantenimiento de la masa ósea. También se proporcionan detalles sobre la capacidad de adaptar el protocolo para evaluar la oxidación de la glucosa o aminoácidos como la glutamina.
El osteoblasto, derivado de las células progenitoras presentes en la médula ósea y el periostio, es responsable de sintetizar y secretar la matriz mineralizada y rica en colágeno que compone el tejido óseo. Para cumplir con este esfuerzo energéticamente costoso y contribuir al mantenimiento de por vida de la integridad esquelética, estas células especializadas mantienen un retículo endoplásmico rugoso abundante esencial para sintetizar proteínas de la matriz extracelular 1,2 y numerosas mitocondrias de alto potencial de membrana para recolectar la energía química requerida de ....
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Este protocolo utiliza la conversión de ácido [1-14C]-oleico en 14CO2 como indicador de la capacidad de oxidación de ácidos grasos. La oficina local de Seguridad Radiológica aprobó el protocolo para el uso de materiales radiactivos antes de iniciar los experimentos. Todos los procedimientos de radiación se realizaron detrás de un escudo de plexiglás con el equipo de protección personal adecuado. El Comité Local de Cuidado y Uso de Animales aprobó el protocolo antes de usar celdas primarias.
1. Oxidación de ácidos grasos en osteoblastos cultivados
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La actividad enzimática de la carnitina palmitoiltransferasa-1 (Cpt1) y la carnitina palmitoiltransferasa-2 (Cpt2) es necesaria para la oxidación mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga. Cpt1 es la enzima limitante de la velocidad en la ruta metabólica, pero tres isoformas (Cpt-1a, Cpt-1b y Cpt-1c) están codificadas en los genomas de los mamíferos, y la interrupción genética de una isoforma puede conducir a la regulación positiva de la compensación de otra isoforma13. Por el contrario, Cpt2 .......
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El procedimiento descrito anteriormente permite la evaluación directa de la oxidación de ácidos grasos, ya que los resultados medidos son 14CO2 recogidos en el papel de filtro empapado en NaOH y metabolitos solubles en ácido recogidos después de la acidificación del cultivo con ácido perclórico. Los kits de ensayo disponibles en el mercado que utilizan moléculas lipídicas marcadas con fluorescencia o análogos lipídicos pueden medir la absorción de lípidos, pero no d.......
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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Este trabajo fue apoyado por un Premio de Revisión al Mérito del Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos de la Oficina de Investigación y Desarrollo (BX003724) de Asuntos de Veteranos y una subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (DK099134).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [1-14C]-Ácido oleico | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
| 15 tapones de goma de 30 mm | VWR | 89097-542 | |
| Jeringa de 1 ml | BD Precision | 309628 | |
| Aguja de 25 G (25 G x 1 1/2 in) | BD precision | 305127 | |
| Ácido ascórbico | Sigma Aldrich | A4403 | |
| BCA Kit de ensayo de proteínas | Thermo Fisher | 23225 | Otros kits también son adecuados |
| Beckman Scintillation Counter, o equivalente | Beckman Coulter | LS6000SC | |
| Beta-glicerol fosfato | Sigma Aldrich | G6626 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | 126609 | |
| Carnitina | Sigma Aldrich | C0283 | |
| Tampón de lisis celular | El protocolo es susceptible de los tampones de lisis típicos (es decir, RIPA)Pinzas | ||
| s Solución salina tamponada con fosfato | Corning | 20-030-CV | |
| Suero | Disponible de múltiples fuentes Tubos de | ||
| microcentrífuga, 1,5 mL | Disponible de múltiples fuentes | ||
| Medio esencial mínimo, modificación alfa | Corning | 10-022-CV | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Ácido perclórico | Sigma Aldrich | 50439 | |
| Pocillos centrales de polipropileno | VWR | 72760-048 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma Aldrich | S5881 | |
| T-25 matraz de cultivo de tejidos de cuello | inclinado Corning | 430639 | |
| cultivo | |||
| Tripsina (0,25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Ultima Gold (Solución de centelleo) | PerkinElmer | 6013329 | |
| Whatman Papel de cromatografía | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
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