Evaluación de la oxidación de ácidos grasos en células óseas cultivadas

Resumen

El presente protocolo describe un ensayo para evaluar la capacidad de oxidación de ácidos grasos en cultivos de células óseas primarias o líneas celulares relevantes.

Resumen

Se espera que la formación ósea mediante la diferenciación de osteoblastos requiera un aporte energético significativo, ya que estas células especializadas deben sintetizar grandes proteínas de la matriz extracelular que componen el tejido óseo y luego concentrar los iones necesarios para su mineralización. Los datos sobre los requisitos metabólicos de la formación ósea están surgiendo rápidamente. Si bien aún queda mucho por aprender, se espera que los trastornos en el metabolismo intermediario contribuyan a la enfermedad esquelética. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la capacidad de las células osteoblásticas para oxidar ¹⁴ácidos grasos marcados con C a ¹⁴CO₂ y metabolitos solubles en ácido. Los ácidos grasos representan una reserva de energía rica que puede ser absorbida de la circulación después de la alimentación o después de su liberación de las reservas de tejido adiposo. El ensayo, realizado en matraces de cultivo de tejidos T-25, es útil para el estudio de la ganancia o pérdida de función de genes en la utilización de ácidos grasos y el efecto de las señales anabólicas en forma de factores de crecimiento o morfógenos necesarios para el mantenimiento de la masa ósea. También se proporcionan detalles sobre la capacidad de adaptar el protocolo para evaluar la oxidación de la glucosa o aminoácidos como la glutamina.

Introducción

El osteoblasto, derivado de las células progenitoras presentes en la médula ósea y el periostio, es responsable de sintetizar y secretar la matriz mineralizada y rica en colágeno que compone el tejido óseo. Para cumplir con este esfuerzo energéticamente costoso y contribuir al mantenimiento de por vida de la integridad esquelética, estas células especializadas mantienen un retículo endoplásmico rugoso abundante esencial para sintetizar proteínas de la matriz extracelular ^1,2 y numerosas mitocondrias de alto potencial de membrana para recolectar la energía química requerida de los sustratos de combustible ^3,4. La importancia de esta última función se ejemplifica con el cese del crecimiento óseo y el desarrollo de osteopenia ^5,6 asociada a déficits energéticos como en la restricción calórica. La identidad de la fuente de combustible preferida del osteoblasto y los datos sobre los requerimientos metabólicos del osteoblasto durante la diferenciación o en respuesta a la señalización anabólica están emergiendo ^7,8.

Los ácidos grasos de cadena larga representan un rico suministro de energía química presente en el suero y liberada por el tejido adiposo en respuesta a una menor ingesta calórica o un mayor gasto energético. Después de atravesar la membrana celular y ligarse a la coenzima A para aumentar la solubilidad, los acil-CoAs grasos son transportados a la matriz mitocondrial por las enzimas carnitina palmitoiltransferasa duales en las membranas mitocondriales externas e internas y la carnitina-acilcarnitina translocasa⁷. Dentro de la matriz mitocondrial, la cadena de maquinaria de β-oxidación acorta el acil-CoA en un proceso de 4 pasos que genera acetil-CoA que entra en el ciclo del TCA (ciclo del ácido tricarboxílico) y equivalentes reductores. El catabolismo del palmitato (C₁₆), los ácidos grasos más comunes en los animales, a través de esta vía produce ~ 131 ATP, sustancialmente más que el ~ 38 ATP generado por la oxidación de la glucosa⁷.

Los estudios de rastreo con lípidos radiomarcados indicaron que el hueso absorbe una fracción significativa de los lípidos circulantes ^9,10, mientras que la ablación genética de enzimas críticas para el catabolismo lipídico conduce a una reducción de la actividad osteoblástica y a la pérdida ósea ^9,11. El protocolo presentado aquí utiliza un ácido graso marcado con ¹⁴C para evaluar la capacidad de los osteoblastos cultivados para metabolizar completamente los ácidos grasos a CO₂ o metabolitos solubles en ácido, que representan pasos intermedios en el proceso de oxidación. Si bien se requiere el uso de radiactividad, el método es sencillo, requiere una inversión limitada y es adaptable para el beneficio de otros metabolitos radiomarcados y tipos de células.

Protocolo

Este protocolo utiliza la conversión de ácido [^1-14C]-oleico en ¹⁴CO₂ como indicador de la capacidad de oxidación de ácidos grasos. La oficina local de Seguridad Radiológica aprobó el protocolo para el uso de materiales radiactivos antes de iniciar los experimentos. Todos los procedimientos de radiación se realizaron detrás de un escudo de plexiglás con el equipo de protección personal adecuado. El Comité Local de Cuidado y Uso de Animales aprobó el protocolo antes de usar celdas primarias.

1. Oxidación de ácidos grasos en osteoblastos cultivados

1. Subcultivo de los osteoblastos primarios de la calvaria¹² o una línea celular osteoblástica como Mc3t3-E1, y placa en matraces T-25 (5 x 10⁵ células/matraz) en α-MEM que contiene 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL de penicilina y 0,1 μg/mL de estreptomicina.
   1. Semilla 3-4 matraces para cada grupo de tratamiento (es decir, control y eliminación de genes o tratamiento vehículo y farmacológico) para su uso en el experimento. Siembre 1-2 matraces adicionales para cada grupo de tratamiento para normalizar el número de células o las concentraciones de proteínas. Incubar los matraces de cultivo en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Cultive las células durante 2-3 días hasta que los matraces se vuelvan confluentes. Induzca los cultivos confluentes para que se diferencien añadiendo 50 μg/mL de ácido ascórbico y 10 mM de fosfato de β-glicerol (véase la Tabla de materiales) a los medios de cultivo y continúe el cultivo durante un máximo de 14 días adicionales.
   NOTA: La inanición del suero (adición de 0.5%-1% FBS) durante la noche es necesaria si se planean tratamientos con factores de crecimiento. La reducción del porcentaje de FBS limita la cantidad de lípidos no radiomarcados en el cultivo y permite el máximo efecto de los factores de crecimiento exógenos. Si se van a probar los efectos de las hormonas, se utiliza FBS sin carbón.
3. Prepare el papel de filtro, los tapones de goma de 15 mm x 30 mm y los pocillos centrales de polipropileno (ver Tabla de Materiales) el día antes del experimento.
   1. Dobla una tira de papel de filtro de 1 cm x 10 cm en forma de abanico y colócala en el cubo del pozo central de polipropileno. Presione el brazo del pozo central de polipropileno a través del centro del tapón del manguito de goma y baje el pozo central de polipropileno en el matraz T-25. A continuación, selle el matraz con el tapón de la manga (Figura 1).
      NOTA: Puede ser necesario ajustar bien la ubicación del centro de polipropileno para asegurarse de que no entre en contacto con el medio de cultivo. Durante el experimento, el pozo central de polipropileno evita que el papel de filtro toque el medio de etiquetado y permite la recolección de ¹⁴CO₂.
4. El día del experimento, conjugó el ácido [^1-14C]-oleico con la albúmina sérica bovina (BSA) mezclando un 20% de albúmina sérica bovina en solución salina tamponada con fosfato (5 μL por matraz) con 0,1 μCi/mL de ácido [^1-14C]-oleico (0,6 μL/matraz) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   1. A continuación, coloque el tubo en un tubo cónico de 50 ml e incube a 37 °C durante 30 minutos agitando suavemente. Prepare 1-2 matraces adicionales para los conjugados de ácido oleico-BSA para tener en cuenta el error de pipeteo.
5. Retire el medio de cultivo del matraz de cultivo de tejidos y reemplácelo con 1,5 mL de medio de inanición de suero fresco (paso 1.2).
6. Para cada matraz, combine 5,6 μL de solución de ácido oleico-BSA (paso 1.4) con 2 μL de solución de carnitina 100 mM y 1 mL de medio de cultivo para producir una solución de etiquetado. Añada la solución de etiquetado a los matraces de cultivo. Conserve el exceso de solución para leer los recuentos totales de actividad agregados al ensayo.
   NOTA: La solución de etiquetado no se añade a los matraces adicionales destinados a cuantificar el número de células o la concentración de proteínas.
7. Baje los pozos centrales de polipropileno que contienen el papel de filtro en el matraz y luego cúbralo con el tapón de goma.
   NOTA: Es fundamental que el pozo central de polipropileno no entre en contacto con el medio de cultivo. Esto conducirá a la contaminación cruzada del papel de filtro con ácido graso radiomarcado en lugar de CO₂.
8. Incubar los cultivos celulares durante 3 h a 37 °C con 5% de CO₂.
9. Para recolectar ¹⁴CO₂, inyecte 150 μL de NaOH 1 N en el pozo central de polipropileno para humedecer el papel de filtro y 200 μL de ácido perclórico 1 M en el medio de cultivo. Inyecte el NaOH y el ácido perclórico empujando una aguja a través del tapón de goma.
   NOTA: El tapón de goma no debe retirarse del matraz. Esto puede hacer que se escapen ¹⁴CO₂ . Para facilitar la inyección, mantenga el matraz en posición vertical y luego regrese a la posición de cultivo una vez completadas las inyecciones.
10. Incubar los matraces a 55 °C durante 1 h.
11. Abra los matraces después de enfriarlos en la campana de cultivo celular. Retire los papeles de filtro de los pocillos centrales de polipropileno con pinzas y colóquelos en 3-4 mL de líquido de centelleo (consulte la Tabla de materiales) en un vial de centelleo.
    NOTA: Se añaden 100 μL de exceso de solución de etiquetado a 3-4 mL del líquido de centelleo para medir los recuentos totales de actividad. Se añaden 100 μL de medio de cultivo basal (sin ácido [^1-14C]-oleico) a 3-4 mL de líquido de centelleo para medir la actividad de fondo.
12. Después de incubar a temperatura ambiente durante 1 h o toda la noche, mida la radiactividad en recuentos por minuto (cpm) usando un contador de centelleo (consulte la Tabla de materiales).
13. Para normalizar los resultados de cpm, aísle los extractos de proteínas de los matraces T-25 no marcados para cada condición de cultivo. Lavar con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato, añadir 1 mL de tampón de lisis celular RIPA a cada matraz y raspar la superficie celular con un raspador celular.
    1. Transfiera el tampón RIPA a un tubo de microcentrífuga con una pipeta y una centrífuga a 19.000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante con una pipeta a un tubo de microcentrífuga nuevo y determine la concentración de proteínas de acuerdo con el protocolo de ensayo BCA (consulte la tabla de materiales).
    2. Divida las lecturas brutas de cpm del contador de centelleo por la concentración de proteína para obtener la cpm normalizada de ¹⁴CO₂ producido (Tabla 1).
14. Siga los requisitos locales para desechar los viales de centelleo, los materiales de cultivo celular, el medio, las jeringas, etc. Descontamine las superficies de trabajo y realice pruebas de limpieza de radiactividad siguiendo los requisitos locales.

2. Recolección de metabolitos solubles en ácido

NOTA: El período de incubación de 3 horas utilizado en el paso 1.8 anterior puede no ser suficiente para oxidar todo el ácido [^1-14C] completamente oleico absorbido por las células a CO₂. El flujo en la vía de oxidación de los ácidos grasos también puede evaluarse midiendo la radiactividad en la fracción soluble en ácido.

1. Recoja 1 mL del medio acidificado de cada matraz T-25 tratado y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Añadir 60 μL de BSA al 20% y 100 μL de ácido perclórico al 16 M.
3. Vórtice e incube durante la noche a 4 °C.
4. A continuación, vórtice y centrifugar a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
5. Añadir 200 μL del sobrenadante al líquido de centelleo y medir la actividad (paso 1.12).
6. Normalice las lecturas a la concentración de proteínas o a las mediciones de ADN (paso 1.13.1).

3. Medición de la oxidación de glucosa u oxidación de aminoácidos

1. Reemplace el ácido oleico marcado con ¹⁴C con glucosa marcada con ¹⁴o ^aminoácidosmarcados con C para medir la oxidación de estas moléculas de combustible.
2. Prepare los cultivos de osteoblastos de acuerdo con los pasos 1.1-1.2.
3. Para iniciar el experimento, retire el medio de cultivo del matraz de cultivo de tejidos y reemplácelo con 1,5 mL de medio de inanición de suero fresco.
4. Prepare una solución de marcaje de 0,6 μCi de ¹⁴glucosa marcada con C o ¹⁴aminoácidos marcados con C en 1 mL de medio de inanición y agréguela a los matraces.
5. Realice los pasos 1.6 a 1.13.

Resultados

La actividad enzimática de la carnitina palmitoiltransferasa-1 (Cpt1) y la carnitina palmitoiltransferasa-2 (Cpt2) es necesaria para la oxidación mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga. Cpt1 es la enzima limitante de la velocidad en la ruta metabólica, pero tres isoformas (Cpt-1a, Cpt-1b y Cpt-1c) están codificadas en los genomas de los mamíferos, y la interrupción genética de una isoforma puede conducir a la regulación positiva de la compensación de otra isoforma¹³. Por el contrario, Cpt2 ...

Discusión

El procedimiento descrito anteriormente permite la evaluación directa de la oxidación de ácidos grasos, ya que los resultados medidos son ¹⁴CO₂ recogidos en el papel de filtro empapado en NaOH y metabolitos solubles en ácido recogidos después de la acidificación del cultivo con ácido perclórico. Los kits de ensayo disponibles en el mercado que utilizan moléculas lipídicas marcadas con fluorescencia o análogos lipídicos pueden medir la absorción de lípidos, pero no d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
[1-14C]-Ácido oleico	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 tapones de goma de 30 mm	VWR	89097-542
Jeringa de 1 ml	BD Precision	309628
Aguja de 25 G (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
BCA Kit de ensayo de proteínas	Thermo Fisher	23225	Otros kits también son adecuados
Beckman Scintillation Counter, o equivalente	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glicerol fosfato	Sigma Aldrich	G6626
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	126609
Carnitina	Sigma Aldrich	C0283
Tampón de lisis celular	El protocolo es susceptible de los tampones de lisis típicos (es decir, RIPA)Pinzas
s Solución salina tamponada con fosfato	Corning	20-030-CV
Suero			Disponible de múltiples fuentes Tubos de
microcentrífuga, 1,5 mL			Disponible de múltiples fuentes
Medio esencial mínimo, modificación alfa	Corning	10-022-CV
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
Ácido perclórico	Sigma Aldrich	50439
Pocillos centrales de polipropileno	VWR	72760-048
Hidróxido de sodio	Sigma Aldrich	S5881
T-25 matraz de cultivo de tejidos de cuello	inclinado Corning	430639
cultivo
Tripsina (0,25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (Solución de centelleo)	PerkinElmer	6013329
Whatman Papel de cromatografía	Sigma Aldrich	WHA3030917

de disección Disponible en múltiples fuentes Kit de cuantificación de ADN Disponible en múltiples fuentes Dulbecco' fetal bovino incubadora de de tejidos