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Artículo de método

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

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DOI:

10.3791/63662

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1 de junio de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Resumen

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Introducción

El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.

Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.

Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.

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Protocolo

1. Materiales y reactivos

  1. Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales).
  2. Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones.
  3. Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes.
    NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este protocolo.
  4. Seleccionar cepas celulares de Aa23 derivadas de huevos de A. albopictus , correspondientes a Aa23-T libre de Wolbachia.

2. Cultivo celular

  1. Preparar matraces de cultivo celularde 25 cm 2 con 4 mL de medio de Schneider con 10% de FBS.
  2. Incubar los matraces a 28 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 durante 5 a 7 días 7,24.
  3. Observe células Aa23 y Aa23-T no teñidas en los matraces utilizando microscopía de luz con un aumento de 100x (Figura 1).

3. Extracción de ADN

  1. Cultive las células durante 5-7 días hasta una confluencia del 70-80% por matraz (paso 2). Cosechar las células con pipeteo manual de 1 mL de medio de cultivo resuspendido por centrifugación durante 5 min a 100 × g en una microcentrífuga.
  2. Retire el sobrenadante por aspiración y almacene el pellet celular resultante a -20 °C.
  3. Resuspender los gránulos en 0,40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), colocar 50 μL de la solución en un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de proteinasa K (20 mg/ml) e incubar a 55 °C durante 1 h. Finalmente, caliente estos tubos a 99 °C durante 15 min para obtener el ADN crudo y almacenarlo a -20 °C.

4. Detección del ácido nucleico Wolbachia

  1. Análisis PCR
    1. Realizar PCR en un volumen total de reacción de 20 μL, que contiene 8 μL de ddH2O, 10 μL de Taq polimerasa (ver la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (del paso 3), 0,5 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') y wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectivamente.
    2. Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C, recocido a 55 °C y extensión a 72 °C; luego, una extensión final a 72 °C durante 7 min.
    3. Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% (1% p/v de agarosa en PBS) utilizando un generador de imágenes de gel.
  2. Análisis qPCR
    1. Analizar la copia del genoma de Wolbachia para tres réplicas biológicas (n = 6) del ADN extraído (paso 3) utilizando cebadores wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') y QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAGTCCC 3')22, normalizados con cebadores de proteína ribosómica S6 (RPS6) hacia adelante y hacia atrás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' y 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)3.
    2. Genere una curva estándar para wAlbB y RPS6.
      1. Extraer ADN de PMD-18T (un vector especial para la clonación eficiente de productos de PCR (clonación de TA)) plásmido recombinante que contiene fragmentos de genes wsp y rps6 (Archivo suplementario) y medir la concentración de ADN plásmido (ver la Tabla de Materiales).
      2. Convierta la concentración de ADN plásmido a la concentración de número de copia usando Eq (1).
        Número de copias del plásmido = figure-protocol-1 (1)
      3. Diluya el número de copia del plásmido de 101 a 108 con agua ultrapura y establezca 3 réplicas para cada gradiente de concentración.
      4. Realice la amplificación de qPCR utilizando TB Green y un sistema de PCR en tiempo real (consulte la Tabla de materiales), y registre los resultados de cada reacción. Utilice el valor Ct para desarrollar una curva estándar. Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 μL, que comprende 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Green (consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de plantilla de ADN (proporcionada por el Paso 3) y 0,8 μL de cebadores hacia adelante y hacia atrás (10 μM). Utilice las siguientes condiciones de reacción: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido a 60 °C durante 35 s.
      5. Calcular los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida y la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6. Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente.
  3. Análisis de Western blot de la proteína Wolbachia
    1. Extracción de proteínas
      1. Recolecte 2 × 107 células Aa23 y Aa23-T de la placa de seis pocillos (a partir del paso 2) en un tubo de microcentrífuga, lávelas tres veces con PBS y centrífuguelas a 100 × g durante 5 min a 4 °C.
      2. Preparar 1 ml de lisados con tampón de lisis RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% dodecil sulfato de sodio [SDS], 2 mM de pirofosfato de sodio, 25 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de EDTA, 1 mM de Na3VO4, 0.5 μg/mL de leupeptina) y PMSF (concentración final de 1 mM).
      3. Agregue 200 μL de tampón de lisis al pellet celular y manténgalo durante 30 minutos en hielo. Centrifugar los lisados a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    2. Evalúe la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Cargue cantidades iguales de proteína en un gel SDS-PAGE al 15% [10% agua destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% persulfato de amonio), 0.04% TEMED].
    4. Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa, bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante 2 h 26,27 a temperatura ambiente, y luego lave las membranas tres veces con TBST (1 ml de Tween 20 en 1 L de TBS) (consulte la Tabla de materiales).
    5. Incubar las membranas durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Archivo Suplementario)), preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5% (1:12.000).
    6. Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.
    7. Incubar las membranas en 100 μL de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en un agitador durante 1 h a temperatura ambiente.
    8. Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 μL de solución A (HRP Substrate Luminol Reagent) y 20 μL de solución B (HRP Substrate Peroxide Reagent) en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de 1:1. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia al mismo tiempo y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.
  4. Localización por inmunofluorescencia de la proteína Wolbachia
    1. Incubar 5 × 105 células Aa23 y Aa23-T a 28 °C en una placa de Petri confocal láser con un espesor de 0,17 mm en la parte inferior, bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante 3 a 4 días 7,24. Espere hasta que la celda tenga una confluencia del 60% al 70% y lave las celdas tres veces con PBS.
    2. Fije las células durante 20 min a 4 °C en 1 ml de paraformaldehído al 4% (p/v) en PBS.
    3. Lave las celdas fijas usando PBST (0.2% v/v Triton X-100 en PBS) durante 5 min y lave las células nuevamente dos veces con PBS.
    4. Incubar los portaobjetos durante 1 h a 37 °C en 1 mL de albúmina sérica bovina al 3% (p/v) en PBS.
    5. Incubar los portaobjetos durante la noche en 100 μL de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón (preparado internamente) y suero de ratón (dilución de 1:1.000 en PBS) en una caja húmeda (puede mantener la humedad y evitar que la humedad se evapore) a 4 °C.
    6. Retire las diapositivas de la caja húmeda y devuélvalas a temperatura ambiente; lávelos tres veces con PBS y retire el PBS.
      NOTA: A partir del paso 4.4.7, todas las operaciones deben estar protegidas de la luz.
    7. Incubar los portaobjetos con 100 μL de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 (dilución 1:2.000 en PBS) a 37 °C durante 30 min.
    8. Incubar los portaobjetos de muestra con 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI diluido en PBS a 10 μg/mL, se une fuertemente al ADN) a 37 °C durante 5 min y luego lavarlos tres veces con PBS.
    9. Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.
      1. Encienda la alimentación y el láser.
      2. Encienda las lámparas normales y de mercurio del microscopio.
      3. Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Coloque una gota de aceite de cedro en los portaobjetos de muestra, coloque los portaobjetos de muestra en el escenario del microscopio y mueva el escenario a la posición adecuada.
      4. Haga clic en el botón de observación de la lámpara de mercurio en el software, abra el obturador de la lámpara de mercurio y observe la muestra bajo un microscopio invertido para enfocar.
      5. Utilice el panel de control manual para seleccionar la fluorescencia verde y azul para tomar fotos de fluorescencia con un aumento de 100x.
      6. Apague el botón de observación de la lámpara de mercurio y comience a adquirir imágenes.
      7. Para garantizar una buena calidad de imagen, realice un escaneo previo por tamaño de escaneo (512 píxeles x 512 píxeles). Ajuste el tamaño del escaneo para obtener imágenes claras (1.024 píxeles x 1.024 píxeles).
      8. Realice la reducción de ruido si el ruido de fondo es demasiado alto.
      9. Deje de escanear y guarde las imágenes.
      10. Apague la lámpara de mercurio y los láseres.
      11. Limpie el objetivo con un 75% de alcohol y baje el objetivo a la posición más baja.
      12. Apague el obturador y la alimentación del microscopio.
      13. Después de que el instrumento se haya enfriado, cúbralo con la cubierta antipolvo.

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Resultados

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando cuatro mét...

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Discusión

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células.

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MicroscopioZeissSteREO Discovery V8
Placa de PetriFisher ScietificFB0875713
PipetaPipetmanF167380P10
inSituX platform
MSE SuppliesCe: Y3Al5O12, YAG sustratos monocristalinos
Soportede chip Software de control desarrollado
Aceite de inmersión
internamente
plataforma inSituXFuente de
internamente Thorlabs IncorporatedLED1085LLED con lente de vidrio, 1085 nm, 5 mW, anillo exterior TO-18
 de bomba desarrollados
internamente Thorlabs IncorporatedLD785-SE400785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, código Pin E, diodo láser
Raspberry PiRaspberry Pi Fundation
Anillo de retenciónThorlabs IncorporatedSM1RRSM1 anillo de retención para Ø Tubos y monturas de lentes de 1"
Cristal de cuarzo sin semillasUniversity Wafers, Inc.U01-W2-L-19051425,4 mm de diámetro Corte en Z 0,05 mm de espesor pulido de doble cara 8 mm en -X
CalceDesarrollado
de haz de rayos XDesarrollado
Software de análisis Granate de aluminio y itrio dopado con cerio internamente desarrollado Cargille Laboratories 16482 Tipo A de baja viscosidad 150 cSt luz IR desarrollada Láseres internamente Tope internamente

Referencias

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