Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

Resumen

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Resumen

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Introducción

El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo¹, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático ^2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección⁴ y pueden curarse de la infección nativa por Wolbac....

Protocolo

1. Materiales y reactivos

1. Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales).
2. Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones.
3. Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes.
   NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este protocolo.
4. Seleccionar cepas celulares de Aa23 derivadas de huevos de A. albopictus , correspondientes a Aa23-T libre de Wolbachia

Resultados

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando cuatro mét.......

Discusión

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio	Zeiss		SteREO Discovery V8
Placa de Petri	Fisher Scietific	FB0875713
Pipeta	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
	MSE Supplies		Ce: Y3Al5O12, YAG sustratos monocristalinos
Soporte	de chip Software de control desarrollado
Aceite de inmersión
			internamente
plataforma inSituX	Fuente de
internamente	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED con lente de vidrio, 1085 nm, 5 mW, anillo exterior TO-18
	de bomba desarrollados
internamente	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, código Pin E, diodo láser
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Anillo de retención	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 anillo de retención para Ø Tubos y monturas de lentes de 1"
Cristal de cuarzo sin semillas	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25,4 mm de diámetro Corte en Z 0,05 mm de espesor pulido de doble cara 8 mm en -X
Calce	Desarrollado
de haz de rayos X	Desarrollado

Software de análisis Granate de aluminio y itrio dopado con cerio internamente desarrollado Cargille Laboratories 16482 Tipo A de baja viscosidad 150 cSt luz IR desarrollada Láseres internamente Tope internamente