La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.
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Artículo de método
Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación
En este artículo
Resumen
Resumen
La dispersión de neutrones ofrece la posibilidad de sondear la dinámica dentro de las muestras para una amplia gama de energías de una manera no destructiva y sin etiquetar más que el deuterio. En particular, la espectroscopia de retrodispersión de neutrones registra las señales de dispersión en múltiples ángulos de dispersión simultáneamente y es muy adecuada para estudiar la dinámica de los sistemas biológicos en la escala de tiempo ps-ns. Al emplear D2O, y posiblemente componentes tampón deuterados, el método permite monitorear tanto la difusión del centro de masa como los movimientos de la columna vertebral y la cadena lateral (dinámica interna) de las proteínas en estado líquido.
Además, la dinámica del agua de hidratación se puede estudiar empleando polvos de proteínas perdeuteradas hidratadas conH2O. Este artículo presenta el flujo de trabajo empleado en el instrumento IN16B en el Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar la dinámica del agua de proteínas e hidratación. Se explica la preparación de muestras de solución y muestras de proteína hidratada en polvo mediante intercambio de vapor. El procedimiento de análisis de datos para la dinámica del agua de proteínas e hidratación se describe para diferentes tipos de conjuntos de datos (espectros cuasielásticos o escaneos de ventana fija) que se pueden obtener en un espectrómetro de retrodispersión de neutrones.
El método se ilustra con dos estudios que involucran proteínas amiloides. Se muestra que la agregación de lisozima en agregados esféricos de tamaño μm -partículas denotadas- ocurre en un proceso de un solo paso en el rango de espacio y tiempo sondeado en IN16B, mientras que la dinámica interna permanece sin cambios. Además, se estudió la dinámica del agua de hidratación de tau en polvos hidratados de proteína perdeuterada. Se muestra que los movimientos de traslación del agua se activan tras la formación de fibras amiloides. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el protocolo sobre cómo se posiciona la dispersión de neutrones con respecto al estudio de la dinámica con respecto a otros métodos biofísicos experimentales.
Introducción
El neutrón es una partícula masiva y sin carga que se ha utilizado con éxito a lo largo de los años para sondear muestras en diversos campos, desde la física fundamental hasta la biología1. Para aplicaciones biológicas, la dispersión de neutrones de ángulo pequeño, la dispersión inelástica de neutrones y la cristalografía y reflectometría de neutrones se utilizan ampliamente 2,3,4. La dispersión inelástica de neutrones proporciona una medición promediada por conjuntos de la dinámica sin requerir un etiquetado específico per se, y una calidad d....
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Protocolo
1. Preparar el tampón deuterado para proteínas en estado líquido
- Disolver todos los componentes del tampón enD2Opuro.
- Si el electrodo de pH se calibró enH2O, ajuste el pD de acuerdo con la fórmula pD = pH + 0.4 usando NaOD o DCl34.
NOTA: El uso de D2O en lugar deH2Opodría afectar la solubilidad de las proteínas y las condiciones tampón podrían necesitar ser adaptadas (por ejemplo, por un ligero cambio en la concentración de sal).
2. Preparar los polvos hidratados H2O-hidratados de proteína perdeuterada<....
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Resultados
La agregación de lisozima en partículas se realizó a 90 °C con una concentración de proteína de 50 mg/mL en un tampón deuterado (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formación de partículas se desencadena por el aumento de la temperatura a 90 °C y se produce dentro de las 6 h (Figura suplementaria S8). La adquisición de datos se realizó en IN16B, como se describe en el protocolo anterior (los datos son seleccionados permanentemente por el ILL y accesibles en http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
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Discusión
La espectroscopia de neutrones es el único método que permite sondear la dinámica ps-ns promediada por conjuntos de muestras de proteínas, independientemente del tamaño de la proteína o de la complejidad de la solución cuando se utiliza la deuteración6. Específicamente, al sondear la autodifusión de ensamblajes de proteínas en solución, el tamaño hidrodinámico de dichos ensamblajes puede determinarse inequívocamente. No obstante, el método está comúnmente limitado por el bajo flujo de neutrones, l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Michaela Zamponi en el Centro Jülich para la Ciencia de Neutrones en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemania, por parte de los experimentos de dispersión de neutrones realizados en el instrumento SPHERES. Este trabajo se ha beneficiado de las actividades del consorcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado por la Unión Europea bajo los Contratos HPRI-2001-50065 y RII3-CT-2003-505925, y de la actividad financiada por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas del Reino Unido (EPSRC) dentro del Institut Laue Langevin EMBL DLAB bajo las subvenciones GR / R99393/01 y EP / C015452 / 1. Se reconoce el apoyo de la Comis....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portamuestras | No disponible en el mercado. El contacto local en el instrumento puede proporcionarlos o se pueden fabricar sobre la base de un dibujo técnico que puede ser proporcionado por el contacto local. | ||
| Cloruro de deuterio, 35 % en peso en D2O, ≥ 99 átomo % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
| Óxido de deuterio (D, 99,9%) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning grasa de silicona de alto vacío | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Etanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Desecador de vidrio | VWR | 75871-660 | |
| Placa desecadora de vidrio, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Alambre de indio, 1,0 mm (0,04 pulgadas) de diámetro, Puratronic, 99,999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lisozima de clara de huevo de gallina dializada, liofilizada, en polvo, ~100.000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | ver github.com/kpounot/nPDyn, funciones del modelo para el montaje también incluido en el software | |
| OHAUS AX324 Adventurer balanza, calibración interna | Dutscher | 92641 | |
| Pentóxido de fósforo, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipeta ErgoOne 0.5-10 μ L | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipeta ErgoOne 100-1.000 μ L | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipeta ErgoOne 20-200 μ L | Starlab | S7100-2200 | |
| Punta de pipeta TipOne 1.000 μ L | Starlab | S1111-6001 | |
| Punta de pipeta TipOne 10 μ L | Starlab | S1111-3200 | |
| Punta de pipeta TipOne 200 μ L | Starlab | S1111-0206 | |
| Solución de deuteróxido de sodio, 40 % en peso en D2O, 99,5 átomo % D | Sigma-Aldrich | 372072 |
Referencias
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
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Reimpresiones y permisos
