Artículo de método

Evaluación de la sensibilidad mecánica de la espalda en la rata para la investigación mecanicista del dolor de espalda crónico

DOI:

10.3791/63667

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30 de agosto de 2022

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1Department of Anatomy, Université du Québec à Trois-Rivières, 2CogNAC Research Group, Université du Québec à Trois-Rivières, 3Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz

En este artículo

Resumen

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Para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para la prevención y el tratamiento del dolor de espalda, se requieren modelos animales para examinar los mecanismos y la efectividad de estas terapias desde una perspectiva traslacional. El presente protocolo describe la prueba BMS, un método estandarizado para evaluar la sensibilidad mecánica de la espalda en la rata.

Resumen

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El dolor lumbar es la principal causa de discapacidad en todo el mundo, con consecuencias personales, económicas y sociales dramáticas. Para desarrollar nuevas terapias, se necesitan modelos animales para examinar los mecanismos y la efectividad de las nuevas terapias desde una perspectiva traslacional. Varios modelos de roedores de dolor de espalda se utilizan en las investigaciones actuales. Sorprendentemente, sin embargo, no se validó ninguna prueba de comportamiento estandarizada para evaluar la sensibilidad mecánica en modelos de dolor de espalda. Esto es crítico para confirmar que los animales con presunto dolor de espalda presentan hipersensibilidad local a los estímulos nociceptivos, y para monitorear la sensibilidad durante las intervenciones diseñadas para aliviar el dolor de espalda. El objetivo de este estudio es establecer una prueba simple y accesible para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas. Se fabricó una jaula de prueba específicamente para este método; largo x ancho x alto: 50 x 20 x 7 cm, con una malla de acero inoxidable en la parte superior. Esta jaula de prueba permite la aplicación de estímulos mecánicos a la espalda. Para realizar la prueba, se afeita la espalda del animal en la región de interés, y se marca el área de prueba para repetir la prueba en diferentes días, según sea necesario. El umbral mecánico se determina con filamentos de Von Frey aplicados a los músculos paraespinales, utilizando el método arriba-abajo descrito anteriormente. Las respuestas positivas incluyen (1) espasmos musculares, (2) arqueamiento (extensión de la espalda), (3) rotación del cuello (4) rascarse o lamer la espalda, y (5) escapar. Esta prueba conductual (Back Mechanical Sensitivity (BMS)) es útil para la investigación mecanicista con modelos roedores de dolor de espalda para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para la prevención y el manejo del dolor de espalda.

Introducción

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El dolor lumbar (DL) es la principal causa de discapacidad en todo el mundo, lo que tiene consecuencias personales, económicas y sociales dramáticas 1,2,3,4. Cada año, aproximadamente el 37% de la población se ve afectada por LBP5. El dolor lumbar generalmente se resuelve en unas pocas semanas, pero recurre en el 24% -33% de los individuos, volviéndose crónico en el 5% -10% de los casos2. Para comprender los mecanismos e impactos del dolor lumbar, así como los efectos de diferentes intervenciones terapéuticas, se han utilizado varios modelos animales de dolor lumbar, imitando condiciones clínicas o algunos componentes del dolor lumbar6. Estos modelos de ratón y rata se pueden clasificar en una o más de las siguientes categorías: (1) dolor lumbar discogénico7,8,, (2) dolor lumbar radicular8,9,10,11, (3) osteoartritis de la articulación facetaria 12 y (4) dolor lumbar inducido por músculo 13,14 . Dado que el dolor no puede ser medido directamente en especies no humanas, se han desarrollado numerosas pruebas para cuantificar comportamientos similares al dolor en estos modelos8. Estas pruebas evalúan comportamientos evocados por un estímulo nocivo (fuerza mecánica 15,16,17, estimulación térmica 18,19,20,21,22,23,24,25) o producidos espontáneamente26,27,28,29.

Los métodos que utilizan estímulos mecánicos incluyen la prueba de Von Frey 15,16 y la prueba de Randall-Selitto17. Los métodos que utilizan estímulos de calor incluyen la prueba de movimiento de cola18, la prueba de placa caliente19, la prueba de Hargreaves20 y la prueba de sonda térmica21. Los métodos que utilizan estímulos fríos incluyen la prueba de placa fría22, la prueba de evaporación de acetona 23 y el ensayo plantar frío24. Los métodos para los comportamientos espontáneos incluyen las escalas de muecas 26, madriguera 27, análisis de soporte de peso y marcha28, así como un análisis de comportamiento automatizado29. A pesar de estas numerosas pruebas disponibles, ninguna de ellas está diseñada específicamente para modelos de dolor de espalda.

El objetivo de este estudio es establecer una prueba simple y accesible para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas. La técnica se basa en gran medida en la prueba de Von Frey aplicada a la superficie plantar de la pata trasera15,16. El principio básico de la prueba de Von Frey es utilizar una serie de monofilamentos para la región de interés, entregando fuerzas constantes predeterminadas. Una respuesta se considera positiva si la rata muestra un comportamiento nocifensivo. El umbral mecánico se puede calcular en función de los filamentos que evocaron respuestas. En el presente estudio, se proporciona un método simple y accesible adaptado de la prueba de Von Frey para determinar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas.

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Protocolo

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El protocolo experimental fue aprobado por el comité de cuidado animal de la Université du Québec à Trois-Rivières y se ajustó a las Directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de los Animales y las Directrices del Comité de Investigación y Cuestiones Éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). El presente estudio utilizó seis ratas Wistar macho (peso corporal: 320-450 g; edad: 18-22 semanas). Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Los datos de estas ratas provienen de la muestra más grande de un estudio previo30.

1. Preparación experimental

  1. Aloje a los animales en una habitación con temperatura controlada en instalaciones estándar para animales con acceso a alimentos y agua ad libitum y un ciclo de luz-oscuridad de 14 h-10 h. Asegúrese de que todos los animales estén en buen estado de salud el día de los experimentos.
  2. Genere el modelo animal de dolor de espalda crónico siguiendo los pasos a continuación.
    1. Para inducir dolor de espalda crónico, realizar una inyección intramuscular de Adyuvante Freund Completo (CFA) en los músculos de la espalda siguiendo los informes anteriores 14,30,31.
    2. Anestesiar al animal con isoflurano (4% para inducción y 2%-2,5% para mantenimiento).
    3. Usando una aguja de 27 G, inyecte 150 μL de una emulsión de agua en aceite lista para usar de CFA (consulte la Tabla de materiales) en los músculos paraespinales de forma unilateral o bilateral, según las necesidades del protocolo.
    4. Mantenga la aguja de inyección en su lugar durante al menos 3 minutos después de completar la inyección. Para los animales en el grupo de control, use los mismos procedimientos30, pero inyecte una solución de solución salina fisiológica estéril (150 μL, 0.9%) en lugar de CFA.
  3. Fabrica la jaula de prueba.
    1. Haga una jaula de prueba para dos animales que comprenda una cámara para cada animal.
      NOTA: Para el presente estudio, cada cámara tiene las siguientes dimensiones: largo x ancho x alto: 50 x 20 x 7 cm (ver Tabla de Materiales).
    2. Monte las dos cámaras contiguas en cuatro patas de plexiglás de 33 cm de largo. Use plexiglás transparente para las paredes de las cámaras, pero use plexiglás negro para separar las cámaras para evitar que los animales se vean entre sí.
    3. Utilice una malla de acero inoxidable hecha de alambre de 1 mm con una distancia entre hilos de 8 mm para hacer el piso y el techo de la jaula de prueba (Figura 1).

2. Prueba de sensibilidad mecánica trasera (BMS)

  1. Familiarice al animal con la jaula de prueba 30 min/día durante 5-7 días consecutivos antes de la primera prueba. Repita la prueba según sea necesario.
  2. Anestesiar a los animales usando isoflurano al 2%31 (ver Tabla de Materiales).
  3. En posición prona bajo anestesia con isoflurano, afeite el pelo posterior del área de interés (de los niveles vertebrales T6 a L6) con un recortador de pelo de animal (ver Tabla de materiales). Para medidas repetidas, afeite el vello de la espalda cada 3 días en un día sin evaluación del comportamiento para garantizar que los estímulos siempre se apliquen directamente sobre la piel. Dibuje una marca negra en la piel con un marcador permanente para asegurarse de que los filamentos siempre se apliquen en la misma área cuando se repita la prueba en días diferentes.
  4. El día de la prueba, coloque a los animales en la jaula de prueba durante 15-30 minutos antes de la prueba hasta que el animal esté tranquilo.
  5. Durante la prueba, aplicar filamentos de Von Frey (0.07, 0.16, 0.4, 0.6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 y 26 g) perpendicularmente a la espalda, siempre comenzando con el filamento de 2 g y utilizando el método arriba-abajo15 (ver Tabla de materiales). Acércate lentamente a la espalda del animal con el filamento por detrás del animal.
    1. Aplique el filamento solo cuando el animal esté despierto, parado sobre sus cuatro patas y sin moverse. Aplicar el filamento durante 2 s bilateralmente a la zona de interés, a 10 mm de la apófisis espinosa (Figura 2), cada 15-30 s.
      NOTA: Una respuesta se considera positiva si el animal exhibe uno o más de los siguientes comportamientos durante o inmediatamente después de aplicar el filamento: (1) espasmos musculares, (2) arqueamiento (extensión de la espalda), (3) rotación del cuello para mirar la espalda, (4) rascarse o lamer la espalda, y (5) escapar.
  6. Como se describió anteriormente15, si no se observa respuesta con la aplicación de un filamento, aplique el siguiente filamento con una fuerza mayor en la serie. Si se observa una respuesta, use el siguiente filamento con una fuerza menor en la serie. Continúe este procedimiento hasta que se obtengan cuatro lecturas después del primer cambio de comportamiento (respuesta después de una serie de "sin respuesta" o sin respuesta después de una serie de "respuesta").
  7. Una vez completada la recolección de datos, calcular el valor que representa el 50% del umbral mecánico, como lo describen Chaplan et al.15, utilizando esta fórmula:
    Umbral del 50% (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
    NOTA: En esta fórmula, "Xf" es la marca de mango del último filamento von Frey que se utilizó. "k" es el valor tabular basado en el patrón de respuesta del animal15, y "δ" es la media de los incrementos de Handle Mark entre los filamentos de Von Frey. Dependiendo del diseño experimental y las necesidades experimentales, solo se puede evaluar un lado de la columna vertebral para informar un umbral, o se pueden evaluar dos lados, y los umbrales se informan por separado o como una media. Consulte el cuadro complementario 1 para la plantilla de cálculo32.

3. Recuperación animal

  1. Después de completar la inyección intramuscular, suspenda la anestesia y coloque al animal solo en una jaula de alojamiento estándar para su recuperación.
  2. Durante el período de recuperación, examine el comportamiento del animal y no lo deje desatendido.
  3. Confirme que el animal se recupera de la anestesia y se mueve normalmente dentro de los 5 minutos. Luego, devuelva al animal a su jaula de alojamiento habitual con los otros animales.
    NOTA: Al final del experimento, el animal se perfunde a través del corazón con una solución de formalina al 10%, bajo anestesia profunda con isoflurano (5%). Los músculos de la espalda en el área inyectada se extraen para la histología y la confirmación de los cambios inflamatorios.

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Resultados

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El método fue utilizado en un estudio previo, en el que se presentaron datos completos y estadísticas para comparar la sensibilidad mecánica de la espalda entre CFA y ratas control30. Los datos individuales representativos (media de los umbrales izquierdo y derecho) de seis ratas incluidas en el estudio anterior se presentan en la Figura 3 y la Tabla 1. Al inicio del estudio, la sensibilidad mecánica fue similar entre los grupos. La inyección intramus...

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Discusión

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Pasos críticos
La prueba BMS es un método simple para evaluar la sensibilidad mecánica en la espalda de ratas, ya sea en un momento dado o repetidamente durante días o semanas, cuando se espera que ocurran cambios (modelos de dolor) o después de una intervención farmacológica o no farmacológica. Los problemas críticos del método incluyen la jaula de prueba, cuyas dimensiones deben garantizar que la rata esté cómoda pero no se mueva demasiado. La espalda del animal debe permanecer accesible a través de...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no hay intereses o relaciones en conflicto que puedan conducir a conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fondation Chiropratique du Québec y el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (MP: subvención #06659). La contribución de HK fue apoyada por la Université du Québec à Trois-Rivières (programa PAIR). La contribución de BP fue apoyada por el Fonds de recherche du Québec en Santé (FRQS) y la Fondation Chiropratique du Québec. La contribución de TP fue apoyada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. La contribución de NE y EK fue apoyada por la Fondation Chiropratique du Québec. La contribución de MP fue apoyada por el FRQS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aerrane (isoflurano, USP) - Solo para uso veterinarioBaxterNDC 10019-773-60Anestésico inhalatorio ; DIN 02225875, para inducir la anestesia
Adyuvante Completo de Freund (CFA)Fisher Scientific#77140Emulsión de agua en aceite de Coadyuvante Completo de Freund (CFA) con células muertas de Mycobacterium butyricum.
Peso corporal de las ratas Wistar macho CharlesRiver Laboratories320– 450 g; Edad: 18-22 semanas.
Penlon Sigma Delta VaporizadorPenlon990-VI5K-SVEEKPenlon Sigma Delta Vaporizador utilizado para la anestesia
Sharpie Marcador Permanente SharpieBC23636Sharpie Permanente, Punta Fina, Negro
Jaula de pruebaaAncho: 20 cm;  Longitud: 50 cm; Altura de abajo hacia arriba: 40 cm; Altura desde la malla inferior hasta la parte superior de la jaula: 7 cm; Espesor de la pared: 5 mm; Malla: alambre de 1 mm con una distancia entre hilos de 8 mm     
Von FreyFilaments Aesthesio, Evaluador Sensorial Táctil Preciso514000-20CFilamentos de 0,07 g a 26 g
Wahl Professional Animal, ARCO Cortadora de mascotas inalámbrica, Recortadora de aseo WahlKit #8786-1201Recortadora de pelo de animal, para afeitar, sin cuchillas 
: Hecho medida

Referencias

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