Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.
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Artículo de método
Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas
En este artículo
Resumen
Resumen
La dispersión Raman estimulada (SRS) y la microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS) son las tecnologías de imágenes de dispersión Raman coherente más utilizadas. Las imágenes hiperespectrales SRS y CARS ofrecen información espectral Raman en cada píxel, lo que permite una mejor separación de las diferentes composiciones químicas. Aunque ambas técnicas requieren dos láseres de excitación, sus esquemas de detección de señales y propiedades espectrales son bastante diferentes. El objetivo de este protocolo es realizar imágenes hiperespectrales SRS y CARS en una sola plataforma y comparar las dos técnicas de microscopía para obtener imágenes de diferentes muestras biológicas. El método de enfoque espectral se emplea para adquirir información espectral utilizando láseres de femtosegundo. Mediante el uso de muestras químicas estándar, se comparan la sensibilidad, la resolución espacial y la resolución espectral de SRS y CARS en las mismas condiciones de excitación (es decir, potencia en la muestra, tiempo de permanencia de píxeles, lente objetivo, energía de pulso). Los contrastes de imagen de CARS y SRS para muestras biológicas se yuxtaponen y comparan. La comparación directa de los rendimientos de CARS y SRS permitiría una selección óptima de la modalidad de imagen química.
Introducción
El fenómeno de dispersión Raman fue observado por primera vez en 1928 por C. V. Raman1. Cuando un fotón incidente está interactuando con una muestra, puede ocurrir espontáneamente un evento de dispersión inelástica, en el que el cambio de energía del fotón coincide con una transición vibratoria de la especie química analizada. Este proceso no requiere el uso de una etiqueta química, por lo que es una herramienta versátil y sin etiquetas para el análisis químico al tiempo que minimiza la perturbación de la muestra. A pesar de sus ventajas, la dispersión Raman espontánea sufre de una sección transversal de dispersión baja (t....
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Protocolo
1. Configuración instrumental para imágenes de CRS hiperespectrales
NOTA: La generación de señal CRS requiere el uso de láseres de alta potencia (es decir, clase 3B o clase 4). Se deben abordar los protocolos de seguridad y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado en todo momento cuando se trabaja a potencias de pico tan altas. Consulte la documentación adecuada antes de la experimentación. Este protocolo se centra en el diseño de la trayectoria del haz, el canto de los pulsos de femtosegundos y la optimización de las condiciones de imagen. En la Figura 1 se muestra un diseño ....
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Resultados
Comparaciones de la resolución espectral
La Figura 2 compara la resolución espectral de la microscopía hiperespectral SRS (Figura 2A) y CARS (Figura 2B) utilizando una muestra DMSO. Para el espectro SRS, se aplicaron dos funciones lorentzianas (ver paso de protocolo 2.3) para ajustarse al espectro, y se obtuvo una resolución de 14,6 cm-1 utilizando el pico de 2.913 cm-1 . Para CARS, se utili.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí describe la construcción de un microscopio CRS multimodal y la comparación directa entre CARS y SRS imaging. Para la construcción del microscopio, los pasos críticos son la superposición espacial y temporal del haz y la optimización del tamaño del haz. Se recomienda utilizar una muestra estándar como DMSO antes de la imagen biológica para optimizar el SNR y calibrar los turnos Raman. La comparación directa entre las imágenes CARS y SRS revela que CARS tiene una mejor resolución espacial, mien.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el fondo de inicio del Departamento de Química de la Universidad de Purdue.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Juego de escáner galvo 2D | Thorlabs | GVS002 | |
| Modulador acústico-óptico | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| AOM | driver Isomet | 532B-2 | |
| Tarjeta de adquisición de datos | National Instruments | PCle 6363 | Filtro personalizado (980 sp) |
| Etapa de retardo | Zaber | X-LSM050A | |
| Deuterio óxido | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| Espejo dicroico para combinación de haces | Thorlabs | DMLP1000 | |
| Espejo dicroico para separación de señales | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa 2 Celdas | ATCC | CRL-1420 | |
| Sistema láser de femtosegundo | Spectral Física | InSightX3+ | |
| Filtro para CARS | Chroma | AT655/30m | |
| Filtro para SRS | Chroma | ET980sp | |
| Generador de funciones | Rigol | DG1022Z | |
| Varillas de vidrio | Lattice Electro Optics | SF-57 | |
| Placa de media onda | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | National Instruments | Este es el software de adquisición de imágenes | |
| Amplificador de bloqueo | Zurich Instrument | HF2LI | |
| Carcasa del microscopio | Olympus | BX51W1 | |
| Lente | objetivo Olympus | ||
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | Este es el software de ajuste espectral | |
| Osciloscopio | Tektronix | TBS2204B | |
| Fotodiodo | Hamamatsu | S3994-01 | |
| Detector PMT | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| PMT amplificador de voltaje | Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
| Cubo divisor de haz polarizador | Thorlabs | PBS255 | |
| Bloque de terminales | National Instruments | BNC-2110 |
Referencias
- Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
- Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
- Evans, C. L., Xie, X. S.
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Reimpresiones y permisos
