El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias
En este artículo
Resumen
Resumen
La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.
Introducción
Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 1,2. P....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Toda la experimentación con tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong / Autoridad Hospitalaria Hong Kong West Cluster (UW13-364 y UW21-695). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de tejidos.
1. Derivación del organoide pulmonar humano
- Preparación de materiales experimentales
- Prepare el medio basal complementando el medio DMEM/F12 avanzado con 2 mM de glutamina, 10 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
- Preparar el medio de expansión organoide pulm....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo permite la derivación de organoides pulmonares humanos con una alta tasa de éxito. El tejido pulmonar humano fresco se pica en trozos pequeños y luego se descompone con colagenasa. Las células individuales resultantes se incrustan en la matriz del basamento y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar complementado con un cóctel de factores de nicho para el crecimiento de células madre epiteliales (paso 1.1.2). La Figura 1 muestra la microfotografía de células pulm.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están implicadas en l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
J. Z., C.L. y M.C.C. figuran como inventores de la patente de organoides de las vías respiratorias (publicación No: US-2021-0207081-A1). Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos al Centro de Ciencias Panorómicas y a la Unidad de Microscopio Electrónico, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, por su asistencia en imágenes confocales y citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Fondo de Salud e Investigación Médica (HMRF, 17161272 y 19180392) de la Oficina de Alimentos y Salud; Fondo General de Investigación (GRF, 17105420) del Consejo de Becas de Investigación; y Health@InnoHK, Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos para el cultivo de organoides pulmonares | |||
| Membrana Basal con Factor de Crecimiento Reducido, Tipo 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamina) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulina β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (medio condicional)hecho en | casa-10x | ||
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µ g/mL |
| Rspondin1 (medio condicional) | hecho en | casa-10x | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µ M |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 y micro; M |
| Diferenciación proximal medio | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µ M |
| Solución de Heparina | Tecnología de células madre | 7980 | 4 y micro; g/mL |
| Solución madre de hidrocortisona | Tecnología StemCell | 7925 | 1 µ M |
| PneumaCult-ALI 10X Suplemento | interfaz aire-líquido | ||
| PneumaCult-ALI Medio basal | StemCell Technology | 05001 | interfaz aire-líquido medio basal |
| PneumaCult-ALI Suplemento de mantenimiento | interfaz aire-líquido | ||
| Tocris | 1254 | 10 µ M | |
| EquipmentCabina de | |||
| seguridad biológica | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 u 800 | Microscopio confocal | Zeiss | |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Microscopio estereoscópico | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Pipeta serológica | Eppendorf | ||
| Micropipeta | Eppendorf | ||
| ZEN negro o ZEN azul software | análisis | Zeiss | |
| Consumables | |||
| 12mm Tecnología Trans-well | StemCell | #38023 | |
| Placa de cultivo celular de 12 pocillos | Cellstar | 665970 | |
| Tubos cónicos de 15 y 50 ml | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Cellstar | 662160 | |
| 6,5 mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Unidad de filtro de jeringa médica, 0,22 y micro; m | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Tubos Microfuge Puntas de | Eppendorf | ||
| Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | ||
| Vaso de pipeta Pasteur | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Pipetas serológicas (5 ml, 10 ml, 25 ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Anticuerpos | |||
| Cabra Anti-Ratón Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Cabra Anti-Ratón, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Cabra Anti-Rata Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Ratón Anti-Citoqueratina 5 | Abcam | ab128190 | |
| Ratón Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Ratón Anti-Mucina 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Ratón Anti-β-tubulina 4 | Sigma | T7941 | |
| Conejo Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rata Anti-Uteroglobina/CC-10 | R& D Systems | MAB4218-SP | |
| fuerte>Otro reactivo | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | enzima de disociación |
Referencias
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. S....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
