Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN
En este artículo
Resumen
Resumen
Los microARN (miARN) han surgido como importantes reguladores celulares (supresores de tumores, factores pro-oncogénicos) del cáncer y la metástasis. La mayoría de los estudios publicados se centran en un solo miRNA al caracterizar el papel de los ARN pequeños en el cáncer. Sin embargo, ~ 30% de los genes de miARN humanos están organizados en unidades agrupadas que a menudo se coexpresan, lo que indica un sistema complejo y coordinado de regulación de ARN no codificante. Se requiere una subestimación más clara de cómo las redes agrupadas de miRNA funcionan cooperativamente para regular el crecimiento tumoral, la agresividad al cáncer y la resistencia a los medicamentos antes de traducir los ARN pequeños no codificantes a la clínica.
El uso de un procedimiento de edición de genes mediado por repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas de alto rendimiento y regularmente interespaciadas se ha empleado para estudiar el papel oncogénico de un grupo genómico de siete genes miRNA ubicados dentro de un locus que abarca ~ 35,000 pb de longitud en el contexto del cáncer de próstata. Para este enfoque, las líneas celulares de cáncer humano se infectaron con un vector de lentivirus para la nucleasa Cas9 inducible por doxiciclina (DOX) cultivada en un medio que contiene DOX durante 48 h. Posteriormente, las células fueron co-transfectadas con ARN CRISPR (tracrRNA) transactivante sintético complejado con oligonucleótidos genómicos de ARN CRISPR específicos del sitio (crRNA) para permitir la rápida generación de líneas celulares de cáncer que transportan toda la deleción del grupo de miRNA y deleciones de grupos de genes miRNA individuales o combinadas dentro de un solo experimento.
Las ventajas de este sistema de edición de genes de alto rendimiento son la capacidad de evitar la subclonación de vectores de ADN que consume mucho tiempo, la flexibilidad en la transfección de células con combinaciones únicas de ARN guía en un formato de 24 pocillos y el genotipado de PCR de menor costo utilizando lisados celulares crudos. Los estudios que utilizan este enfoque simplificado prometen descubrir redundancias funcionales e interacciones sinérgicas / antagónicas entre los miembros del grupo de miRNA, lo que ayudará a caracterizar las pequeñas redes complejas de ARN no codificante involucradas en la enfermedad humana e informará mejor el diseño terapéutico futuro.
Introducción
Se necesitan mejores herramientas de investigación para investigar la contribución de los ARN no codificantes en las enfermedades humanas. La desregulación del MiRNA se observa a menudo en trastornos humanos como el cáncer cuando se comparan los perfiles de expresión de estos pequeños ARN no codificantes en los tejidos y fluidos corporales (por ejemplo, sangre, orina) de pacientes con cáncer versus no cáncer, individuos sanos, empleando microarrays, PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y tecnologías de secuenciación profunda de próxima generación 1,2 . Trabajos recientes han caracterizado un gran subconju....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación para la edición de genes CRISPR y diseño de ARN guía para generar líneas celulares knockout de grupos de miRNA
- Cree un archivo de ADN que contenga la secuencia genómica completa de la región del grupo de miRNA de interés (intergénica, intrónica) y al menos 1 kB de las regiones genómicas circundantes utilizando un programa de software de anotación de secuenciade ADN 19.
- Utilice una herramienta de edición de características en el archivo de ADN creado para marcar el locus del cúmulo de miRNA objetivo (intergénico, intrónico) y cada secuencia de horquilla de miRNA individual que per....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo de deleción CRISPR de alto rendimiento se empleó con éxito utilizando la transfección de líneas celulares de cáncer humano LNCaP e PC3-ML inducibles por Cas9 con ARN guía de oligonucleótidos sintéticos dirigidos al grupo miR-888, que se estudiaron en el contexto del cáncer de próstata. El grupo miR-888 se identificó inicialmente en una prueba de perfil de expresión como elevado en pacientes con cáncer de próstata con enfermedad de alto grado en comparación con pacientes de bajo grado y no.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este procedimiento de edición de genes CRISPR permite al investigador generar rápidamente un panel completo de líneas celulares que llevan combinaciones únicas de deleción de grupos de miRNA. La transfección de ARN guía sintéticos compuestos por ARNcr genómicos específicos del sitio 5' y 3' recocidos con arNN trazado sintético (relación molar 1:1) en este protocolo evita la subclonación vectorial de plásmidos que consume mucho tiempo y permite un diseño experimental más flexible y de alto rendimiento utilizando un format.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Las líneas celulares PC3-ML fueron amablemente proporcionadas por Mark Stearn (Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel). Justin Toxey ayudó en el genotipado de PCR. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Breedan Adams, un Fondo de Investigación Traslacional Ryan y una Subvención de la Junta de Investigación de Salud de la Commonwealth (CHRB-274-11-20) a AE-K.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de 0,2 mL, tapa plana | Fisher | 14-230-225 | |
| Plasticware Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | , genotipado |
| Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Fisher | FB012927 Plasticware | |
| placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Falcon | 08-772-2C | Plasticware Anticuerpo |
| anti-CRISPR-Cas9 [7A9-3A3], | blot AbCam | ab191468 | ; 160 kDa; dilución 1:200 |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue reactivo |
| de cultivo BLAST motor de búsqueda de nucleótidos Centro Nacional de | Información Biotecnológica | NA | Freeware; sitio web: |
| blast.ncbi.nlm.nih.gov Blasticidina S, clorhidrato, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | reactivo CRISPR; Químico, Material de trabajo = 1 mg/mL en agua |
| Countess 3 Contador de células automatizado | Invitrogen | A50298 | Equipo; Contador |
| de células Tubos criogénicos | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Herramienta de diseño | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; sitio web: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Reactivo de transfección; Líneas celulares LNCaP y PC3-ML |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher | BP231100 | Reactivo de cultivo Tisuue |
| DMEM Medio con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio | Reactivo de | cultivo de Corning MT10013CV Tisuue; Medios para células PC3-ML | |
| Clorhidrato de doxiciclina, solución preparada | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | reactivo CRISPR; Químico, Material de trabajo = 1 mg/mL de material en agua |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | Gibco | 14190144 | Reactivo de cultivo Tisuue |
| Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintético, 20 nmol, diseñado | por Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | Reactivo CRISPR; Oligonucleótidos de tracrRNA universal |
| Edit-R Synthetic Modified crRNA, desalado/desprotegido, 2 nmol | Dharmacon, Inc. | reactivo CRISPR crRNA-460XXX | ; Diseño de oligonucleótidos crRNA |
| EditR Partículas de nucleasa lentiviral inducible hEF1aBlastCas9, 50 μ L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | reactivo CRISPR; Lenti-iCas9; Sistema vectorial Lentiviral inducible por doxiciclina Streptococcus pyogenes Cas9 |
| Visor genómico | Ensembl | NA | Freeware; sitio web: [ensembl.org] Uso: Navegador de genoma para identificar una secuencia de nucleótidos que contiene el grupo de miRNA y las secuencias de genes/reguladores circundantes. |
| Anticuerpo GAPDH (FL-335), policlonal | conejo Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Reactivo de Western blot; 37 kDa; dilución 1:500 |
| Gel/PCR Kit de extracción de fragmentos de ADN | IBI Scientific | IB47010 Reactivo de electroforesis en gel de ácido nucleico | |
| Gibco Suero fetal bovino, certificado | Gibco | 16000044 | Reactivo de cultivo Tisuue |
| Bromuro de hexadimetrina | MilliporeSigma | CRISPR H9268 | ; Químico, Material de trabajo = 0,8 mg/mL |
| Membrana de PVDF Immobilon-FL | MilliporeSigma | IPFL10100 | reactivo de Western blot; |
| Intercept (TBS) | LI-COR | 927-60001 | Reactivo Western blot |
| IRDye 680RD Cabra anti-ratón Anticuerpo secundario IgG | LI-COR | 926-68070 | Reactivo Western blot |
| IRDye 800CW Cabra anti-Conejo Anticuerpo secundario IgG | LI-COR | 926-32211 | reactivo Western blot |
| Eppendorf | 5425 R | Plasticware | |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; sitio web: [mirbase.org] Uso: Borowser enumera todas las horquillas de miRNA anotadas, secuencias de miRNA maduras y mapeo de miRNAs agrupados asociados dentro de 10 kb. |
| NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Gel de Proteínas, 10 pocillos | Invitrogen | NP0321BOX | Reactivo de Western blot |
| imágenes Odyssey CLx Equipo | LI-COR | CLx | ; Imágenes de Western blot |
| Opti-MEM Medio de suero reducido | Gibco | 31985062 | Reactivo de transfección |
| Owl D2 Sistema de electroforesis de gel ancho | Owl | D2-BP | Equipment; Sistema de electroforesis en gel de ácido nucleico |
| Imprimaciones de PCR, diseñadas (oligonucleótidos de ADN monocatenario) | Tecnología de ADN integrada | Reactivo | PCR NA, genotipado |
| Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad (2 U/µ L) | Reactivo | Thermo Scientific F530S | , genotipado |
| Tampón de lisis RIPA 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Reactivo de Western blot |
| Solución de proteinasa K (20 mg/mL), grado de ARN | Invitrogen | 25530049 | reactivo de PCR, genotipado |
| ARNasa A, DNasa y proteasa (10 mg/mL) | Reactivo de PCR | Thermo Scientific | EN0531 |
| RPMI 1640 Medio | Reactivo de cultivo Gibco | MT10041CV | Tisuue; Medios para células LNCaP |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; sitio web: [snapgene.com] Uso: Programa de software de anotación de secuencia de ADN para crear un archivo de ADN para el diseño de ARNg y que destaca el locus del grupo de miARN (intergénico, intrónico), cada secuencia de horquilla de miARN individual que pertenece al grupo de miARN y otros genes codificantes y no codificantes cercanos y/o características reguladoras |
| Enzima TrypLE Select (1x), reactivo | Gibco | 12563029 | Tisuue rojo sin fenol; Tripsina recombinante |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Reactivo de electroforesis en gel de ácido nucleico |
| Veriti Termociclador rápido de 96 pocillos | ThermoFisher Scientific | 4375305 | |
| Equipment XCell SureLock Mini-Cell Electroforesis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Sistema de electroforesis en gel de proteínas |
Referencias
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
