Imágenes químicas multiplex basadas en microscopía de dispersión Raman estimulada por banda ancha

La microscopía Raman es una poderosa técnica de imagen que proporciona mapas químicos ricos mediante la medición de la dispersión Raman¹, un proceso radiativo inelástico que se origina a partir de moléculas que vibran en respuesta a la luz incidente ^2,3. Cada píxel de un mapa Raman contiene un espectro que lleva información directa sobre la composición química y la estructura de la muestra, lo que resulta en imágenes con contraste vibratorio intrínseco. Hasta la fecha, la microscopía Raman es el punto de vista de referencia para los estudios de microespectroscopía de vibraciones moleculares, ya que ninguna otra técnica de imagen puede producir imágenes con alta especificidad química y alta resolución espacial⁴. A pesar de su excelente especificidad química, la eficiencia de generación de la dispersión Raman es baja, lo que requiere tiempos de permanencia de píxeles prolongados o excitación de alta potencia, lo que lleva, respectivamente, a bajas tasas de adquisición e incompatibilidad con muestras sensibles.

Esta deficiencia única de microscopía Raman llevó a los investigadores a aplicar la dispersión Raman coherente ^5,6,7,8,9 como fuente de contraste para la microscopía. Este es un proceso óptico no lineal que mejora la respuesta vibratoria en varios (hasta siete) órdenes de magnitud, lo que permite imágenes químicas de alta velocidad 10,11,12,13. En particular, las dos técnicas de dispersión Raman coherentes más empleadas son la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS)¹⁴ y la dispersión Raman estimulada (SRS)¹⁵. A diferencia de CARS, SRS muestra una dependencia lineal de la concentración de moléculas resonantes. Es inmune al fondo no resonante, un efecto no lineal no relacionado con ninguna transición vibratoria pero distorsionador a las formas lorentzianas características de los espectros Raman de las vibraciones moleculares^16,17. Por lo tanto, la microscopía SRS produce información Raman auténtica que permite el análisis cuantitativo directo de imágenes.

SRS es un proceso óptico no lineal de tercer orden que proporciona información directa sobre los enlaces químicos de una muestra. Se origina a partir de la superposición espaciotemporal de dos campos ópticos generalmente en la región espectral del infrarrojo cercano, a saber, la bomba y los Stokes a la frecuencia ω_pu y ω_S, respectivamente 10,11,18. Esta superposición genera un latido en la frecuencia de la bomba-Stokes desajustando Ω = ω_{pu-ω S}. Cuando Ω coincide con una vibración molecular Ω_R, la molécula resuena, causando una transferencia de energía coherente entre los campos de luz y la molécula. Como resultado, la molécula alcanza un estado excitado vibratoriamente. Este proceso se puede monitorear midiendo la aniquilación de los fotones de la bomba (una señal conocida como pérdida de Raman estimulada [SRL]) o la amplificación concomitante de fotones de Stokes (un proceso conocido como ganancia de Raman estimulada [SRG]). SRG y SRL son señales pequeñas (ΔI) que se encuentran sobre un fondo intenso y fluctuante (I). Como los valores típicos de la señal SRS (ΔI /I) están en el rango 10-6-10-4, el ruido del láser puede oscurecerlo fácilmente. Para mitigar los efectos perjudiciales del ruido láser en la relación señal-ruido (SNR) y, en consecuencia, en la velocidad de imagen, la detección SRS se basa en técnicas de transferencia de modulación (por ejemplo, amplificadores de bloqueo, circuitos resonantes o promediadores de box-car) a altas frecuencias de modulación (>1 MHz), donde el ruido láser alcanza sus valores mínimos 15,19,20.

La microscopía SRS convencional emplea una bomba de banda estrecha (≈10 cm⁻¹) y pulsos Stokes para producir imágenes químicas a una sola frecuencia vibratoria, lo que permite imágenes de velocidad de video con tiempos de permanencia de píxeles tan bajos como ≈100 ns^21,22. Sin embargo, debido a que la microscopía SRS de banda estrecha forma mapas químicos escaneando secuencialmente la muestra a solo unas pocas frecuencias vibratorias, su información es limitada²³. Las imágenes SRS con uno o dos contrastes vibratorios pueden no ser suficientes para diferenciar especies químicas con bandas Raman superpuestas, especialmente dentro de sistemas heterogéneos. Por lo tanto, el microscopio SRS paradigmático de banda estrecha no explota todo el potencial de SRS, porque la investigación de un puñado de frecuencias vibratorias dificulta su especificidad química y descuida la riqueza de información codificada dentro de los espectros vibratorios. Además, el escaneo secuencial de la muestra a diferentes frecuencias da como resultado tiempos de permanencia de píxeles prolongados que pueden desencadenar el fotodaño y evitar la corregistración espacial rigurosa entre imágenes consecutivas, lo que lleva a artefactos de movimiento.

Contrariamente a su contraparte de banda estrecha, la microscopía SRS de banda ancha recupera un espectro vibratorio por píxel en cada escaneo de muestra 10,12,24. Por lo tanto, el SRS de banda ancha proporciona imágenes hiperespectrales con una estricta corregistración espacial de diferentes contrastes vibratorios, lo que permite un análisis riguroso de los datos. Esto no solo revela los componentes químicos del espécimen a través de espectros Raman, sino que también ayuda a determinar sus concentraciones relativas. Dependiendo de cómo se adquieran los espectros, la microscopía SRS de banda ancha se clasifica como SRS hiperespectral o SRS multiplex. En srsis hiperespectral, el espectro SRS por punto escaneado de la muestra se adquiere secuencialmente (es decir, se recupera barriendo la Ω de desajuste de frecuencia), construyendo un espectro SRS apilando las señales SRS en turnos Raman consecutivos. El espectro Raman se mide simultáneamente en varios modos vibratorios en SRS multiplex. Por lo tanto, el enfoque SRS multiplex combina un pulso de banda estrecha modulado con un pulso de banda ancha para impulsar la señal SRS a diferentes frecuencias, y utiliza un detector multicanal con una sensibilidad comparable a la de SRS de banda estrecha para detectar los espectros SRS.

Este artículo presenta un protocolo para producir mapas químicos de muestras heterogéneas utilizando microscopía SRS multiplex. Un esquema del microscopio SRS empleado en este protocolo se representa en la Figura 1 y se describe en detalle en otra parte 25,26,27. Brevemente, un láser de fibra Yb bloqueado en modo comercial, que produce pulsos de 140 fs centrados a 1040 nm, con una potencia promedio de 10 W y una tasa de repetición de 80 MHz, impulsa el microscopio SRS de banda ancha. Un divisor de haz polarizador (PBS) separa el haz fundamental en dos ramas. Para producir los pulsos Stokes de banda estrecha, una rama con 4 W del haz fundamental se envía a un etalón que genera un haz de banda estrecha (≈15 ^cm-1), que luego se modula a 1,6 MHz con un modulador óptico acústico (AOM). La fracción restante con 6 W del haz fundamental se duplica en frecuencia con un cristal de triborato de litio (LBO) de 2,8 mm de espesor, cortado para la coincidencia de fase de tipo I (θ = 90 °, φ = 13,8 °). La segunda generación armónica resultante a 520 nm viaja a una cavidad plegada en X para bombear un oscilador paramétrico óptico (OPO), un dispositivo que utiliza un cristal LBO de 3,0 mm de espesor (coincidencia de fase tipo I, θ = 90 °, φ = 9,8 °) como medio activo para entregar una radiación óptica de banda ancha sintonizable dentro de la región espectral de 680-910 nm (Figura 2). Estos pulsos de banda ancha sirven como bomba en los experimentos SRS y se propagan a un compresor de prisma para precompensar los efectos de dispersión inducidos por el objetivo del microscopio.

Después de la etapa de compresión, una placa de onda λ/2, combinada con una placa birrefringente YVO₄ , produce dos réplicas polarizadas ortogonalmente cuya sustracción electrónica en el plano de detección cancela el ruido de la bomba de banda ancha. Un espejo dicroico combina la bomba y los haces stokes y los envía a un microscopio vertical. Un objetivo de inmersión en agua con una apertura numérica (NA) de 1,27 enfoca la luz en la muestra, mientras que un objetivo de inmersión en aceite con un NA de 1,4 la recoge. Antes de la etapa de detección, un filtro de paso corto (SPF) elimina los Stokes modulados, mientras que una rejilla de difracción que funciona en configuración Littrow dispersa la bomba de banda ancha transmitida. Un segundo PBS₂ separa las réplicas de la bomba y una lente las enfoca en dos matrices de fotodiodos. Las señales de estas matrices de fotodiodos se restan electrónicamente y se envían a un amplificador de bloqueo multicanal (M-LIA) construido en casa. La señal demodulada se normaliza mediante las lecturas de corriente continua (CC) de una de las matrices de fotodiodos, produciendo así el espectro SRL.

Como experimento ejemplar, obtenemos imágenes de mezclas de varios dispersores Raman conocidos, cada uno con un espectro Raman único. Por lo tanto, el protocolo comienza describiendo cómo preparar las muestras de referencia. A medida que detectamos SRL, continuamos explicando cómo obtener pulsos Stokes de banda estrecha y configurar la fuente óptica que entrega los pulsos de bomba de banda ancha (≈250 ^cm-1), es decir, el OPO casero. El protocolo muestra la alineación y optimización de los haces ópticos, describiendo parámetros críticos como la potencia y los espectros de la banda estrecha Stokes y la bomba de banda ancha. El protocolo describe en detalle la ruta óptica de la bomba de banda ancha porque requiere elementos ópticos especiales. También explica cómo encontrar la superposición espaciotemporal entre los pulsos de bomba-Stokes y muestra una forma práctica de determinar el ruido de intensidad relativa (RIN), que a su vez ayuda a definir la mejor frecuencia de modulación para los experimentos de SRS. A continuación, explicamos el principio de funcionamiento y la calibración de la cadena de detección. Finalmente, el protocolo muestra el proceso de adquisición de datos, la quimiometría y la canalización de procesamiento de imágenes.

1. Preparación de la muestra

NOTA: Este protocolo describe la recuperación de los mapas de concentración y espectros SRS característicos de mezclas químicamente heterogéneas.

1. Para preparar la muestra, extraiga 2 μL de una suspensión acuosa de microperlas de polimetacrilato de metilo (PMMA) (consulte la Tabla de materiales) y vierta la fracción de 2 μL en un cobertor de microscopio.
   1. Con una punta de pipeta limpia, extraiga 2 μL de una suspensión acuosa de microperlas de poliestireno (PS) y combínela con la suspensión de PMMA en el cobertor. Usando una punta de pipeta, mezcle suavemente la suspensión y déjela secar durante 24 h.
      NOTA: Es importante hacer coincidir cuidadosamente la concentración de las suspensiones de microperlas para evitar cantidades desproporcionadas de las microperlas en la superficie de la muestra. El diámetro de las perlas PS y PMMA es de 10 y 6 μm, respectivamente. Estas dimensiones permiten demostrar la alta resolución espacial del microscopio sin comprometer la eficiencia de generación de SRS.
2. En la parte superior de la capa plana y blanca de cuentas que aparecerán cuando el agua se seque, agregue 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y luego 20 μL de aceite de oliva puro.
3. Aplique esmalte de uñas en los bordes de una segunda funda de microscopio. Coloque el trozo de cubierta sobre la mezcla, con el esmalte de uñas hacia abajo, aplicando suficiente presión para sellarlo. Déjalo secar.
   NOTA: La Figura 3 muestra resultados ejemplares obtenidos con estos pasos. Si se sella correctamente, esta muestra debe durar hasta tres meses.

2. Optimización de la bomba y las vigas Stokes

1. Encienda el láser y deje que alcance el equilibrio térmico. Aplicar una dispersión de retardo de grupo negativo (GDD) de GDD = -6.000 fs² al haz fundamental.
   NOTA: Este valor de GDD es crítico para conducir correctamente el OPO y es óptimo para esta configuración, pero es probable que varíe en diferentes sistemas. El GDD negativo se puede introducir a través de pares de rejillas, compresores de prisma o moldeadores de pulsos basados en moduladores de luz espacial²⁸.
2. Divida el láser fundamental con un divisor de haz polarizador (PBS₁) en dos ramas. Para obtener los pulsos Stokes de banda estrecha, guíe una rama con 4 W a un etalón. Gire ligeramente el etalón hasta obtener una línea espectral estrecha y centrada en el pico del espectro de pulso (ver la curva roja en la Figura 2).
   NOTA: Este etalón tiene una finura efectiva de 29 y un rango espectral libre de 29,8 nm a 1.040 nm.
3. Para obtener pulsos stokes modulados, envíe el haz de banda estrecha a un modulador acústico-óptico.
   NOTA: Como se muestra en la Figura 4A, el haz difractado de primer orden experimenta una modulación del 100%, mientras que el de orden cero solo el 50%. Por lo tanto, es preferible emplear el primer orden para evitar iluminar la muestra con un haz no modulado fuerte que pueda inducir fotodaño de muestra sin generar ninguna señal SRS.
   1. Para optimizar la eficiencia de la modulación, cambie la distancia entre las lentes f₁ y f₂ (Figura 4B). Mide el haz modulado con un fotodiodo y registra su perfil con un osciloscopio.
   2. Cambie la distancia entre f₁ y f₂ hasta que se logre el máximo contraste entre la amplitud y la línea de base de las lecturas del osciloscopio.
      NOTA: Este par de lentes no funciona como un colimador, sino que crea un punto focal efectivo en el cristal de la OMA.
   3. Coloque una tercera lente f₃ para afinar la cintura del haz de Stokes, permitiendo cambiar el volumen de interacción en el plano focal del microscopio y, en consecuencia, optimizar la señal SRS.
      NOTA: El haz de Stokes fue modulado a 1,6 MHz en este protocolo.
4. Enfoque los 6 W restantes de la potencia óptica del haz fundamental en un cristal de triborato de litio (LBO) (LBO_1, θ = 90°, φ = 13.8°) para duplicar la frecuencia del haz fundamental a través de la segunda generación armónica (SHG) (Figura 5A).
   1. Para maximizar la eficiencia de SHG, gire ligeramente el cristal, variando el ángulo de φ (Figura 5B). Optimice LBO₁ para obtener al menos 2,5 W de SHG.
5. Ajuste el ángulo de φ de LBO₂ para maximizar la eficiencia de generación del haz de señal.
   NOTA: Las distancias focales de las lentes f₁, f₂ y f₃ se eligieron cuidadosamente para hacer coincidir el haz SHG con la cavidad OPO. Por lo tanto, las distancias focales de estas lentes variarán en diferentes configuraciones. Debido a la dispersión residual en la cavidad OPO, un ligero cambio en la longitud de la cavidad induce un cambio del espectro del haz de señal.
   1. Ajuste la longitud de la cavidad para obtener un espectro de bomba que, junto con el Stokes de banda estrecha a 1.040 nm, puede producir una desafinación de frecuencia dentro de 1.373-5.090 ^cm-1. Este rango cubre las vibraciones en la región espectral de estiramiento CH (2.800-3.050 ^cm-1). Vea los espectros azules en la Figura 2.
6. Para compensar los efectos de dispersión inducidos por el objetivo del microscopio de excitación, envíe la bomba de banda ancha a un compresor de prisma. Ingrese la bomba en el prisma A a través de su ápice y guíe la bomba dispersa hacia el ápice del prisma B. Defina la cantidad de dispersión negativa necesaria y luego establezca la distancia entre los ápices L de los prismas en consecuencia.
   NOTA: La Figura 6 muestra la disposición de los prismas²⁹. En este caso, la compensación se fijó para GDD ≈ -12.800 fs²; por lo tanto, L = 1,26 m.
   1. Use prismas cortados por Brewster.
      1. Asegúrese de que la polarización del haz de la bomba se encuentre dentro de los planos triangulares de los prismas (caras superiores / inferiores sin pulir).
      2. Asegúrese de que el ángulo de incidencia θ_en el haz de la bomba coincida con el ángulo de Brewster.
      3. Asegúrese de que la cara de salida del prisma A sea paralela a la cara de entrada del prisma B.
   2. Para estimar el GDD del pulso de banda ancha a compensar, mida la señal SRS en una sola longitud de onda λ₁, registrando el retardo de tiempo τ₁ entre bombas-Stokes en el que se obtiene el SRS(λ₁) máximo. Repita este procedimiento para una segunda longitud de onda λ₂, registrando nuevamente el retardo de tiempo τ₂ en el que el SRS(λ₂) fue máximo.
      NOTA: Debido a que el GDD se define como la derivada del retardo de grupo con respecto a la frecuencia angular, las mediciones antes mencionadas permiten la estimación del GDD del haz de banda ancha (Eq [1]).
      (1)
7. Usando una placa de onda λ/2, ajuste la polarización del haz de la bomba a 45°. Guíe la bomba polarizada a una placa YVO₄ con una longitud de 13,3 mm, ajustando el eje rápido de esta vertical de cristal birrefringente.
   NOTA: Al viajar a través de la placa YVO₄ , los pulsos de la bomba se dividirán en dos réplicas polarizadas ortogonalmente que se propagan de forma collinearly pero manteniendo un retardo Δt ≈ 10 ps entre ellos. Este retraso es una función del grosor y los índices de refracción del cristal birrefringente. A partir de ahora, las réplicas de la bomba con el mismo estado de polarización de los pulsos de Stokes se denominarán "señal" mientras que las que tengan un estado ortogonal como "referencia". Los detalles de esta técnica, llamada detección equilibrada en línea, se han descrito anteriormente³⁰.
8. Combine la bomba y los haces Stokes con un espejo dicroico y alinee cuidadosamente usando un par de agujeros fluorescentes, asegurando que ambos se propaguen de manera colateral. Atenúe los haces y use una lente para enfocarlos en un fotodiodo rápido (al menos 100 MHz de ancho de banda).
   1. Bloquee la bomba y mida pulsos Stokes individuales con un osciloscopio digital de gran ancho de banda. Utilice la señal de disparo del láser como fuente de reloj para las mediciones del osciloscopio. Determine el valor medio en el que el voltaje del fotodiodo alcanza su máximo.
   2. Bloquee el haz de Stokes y repita este procedimiento para los pulsos de la bomba. Aumente o reduzca la trayectoria óptica del haz de la bomba (Stokes) hasta que sus pulsos lleguen aproximadamente al mismo tiempo que los pulsos de Stokes (bomba).
      NOTA: Esto debería garantizar una precisión de unos pocos milímetros como máximo en la coincidencia de la diferencia de trayectoria óptica entre los dos brazos.
   3. Retire el fotodiodo y coloque un cristal no lineal con un ángulo de corte adecuado para la generación de suma-frecuencia (SFG) entre los fotones de La bomba-Stokes.
      NOTA: El cristal no lineal utilizado aquí se cortó para la coincidencia de fase tipo I, θ = 90 °, φ = 9.8 °. El eje óptico del cristal no lineal debe ser paralelo a la polarización de los stokes y los pulsos de señal.
   4. Haga que los haces de la bomba/Stokes sean ligeramente no colineales y mueva la línea de retardo hasta el SFG, una señal que, debido a la coincidencia de fase, se encuentra entre los SHG de la bomba y los haces de Stokes. Si no se encuentra la señal, verifique la superposición espacial de los dos haces en el cristal.
      NOTA: El SFG está desplazado hacia el azul y debe ser fácilmente visible a simple vista.
   5. En caso de dificultades inesperadas, coloque un filtro de paso bajo para quitar la bomba y Stokes y sus respectivos SHG y mida el SFG con un espectrómetro (Figura 7A). Encuentre el retardo de tiempo en el que el SFG alcanza su intensidad máxima, un valor que determina la superposición espaciotemporal ideal requerida para la generación de señal no lineal, y fije la línea de retardo allí (Figura 7B).
9. Mida los perfiles del haz con una cámara calibrada. Alternativamente, use una tarjeta infrarroja y calcule los diámetros a ojo. Utilice dos telescopios, uno para la bomba y otro para el haz stokes. Con estos telescopios, trate de hacer coincidir los diámetros del haz con la apertura posterior del objetivo de excitación.
   NOTA: Este procedimiento garantizará la máxima resolución espacial de la configuración.
   1. Una vez obtenida la señal SRS, utilice el telescopio en el haz de la bomba para ajustar su diámetro, variando su rango de Rayleigh y, en consecuencia, el volumen de interacción en el foco del microscopio. Deténgase cuando se alcance el SRS máximo.
10. Utilice un fotodiodo para medir la intensidad del haz de la bomba (Stokes) y, con la responsabilidad del fotodiodo, calcule la potencia media que incide en el área activa del detector.
    1. Si utiliza un fotodiodo de gran ancho de banda, conecte un filtro electrónico de paso bajo para obtener solo el componente constante o de CC. Para medir δP(f), conecte la salida de un fotodiodo de alto ancho de banda (desconecte el filtro de paso bajo) a la entrada de un amplificador de bloqueo. Almacene la salida de bloqueo en diferentes frecuencias de demodulación y use la responsividad del fotodiodo para convertir de V a W.
       NOTA: Los amplificadores de bloqueo comerciales tienen herramientas incorporadas para medir δP(f) (por ejemplo, Zurich Instruments incorporó a LabOne una barredora de frecuencia³¹).
    2. Después de medir el RIN de los haces, apague el láser y mida el ruido electrónico (es decir, el RIN calculado sin ninguna luz en los detectores).
       NOTA: Siempre que el RIN esté limitado por las fluctuaciones del láser y no por el ruido de disparo, esta medición oscura ayudará a diagnosticar la instrumentación empleada para las mediciones; si el ruido electrónico es tan alto como el RIN del láser, esto no se puede utilizar para medir el RIN del láser; Es posible que haya que utilizar amplificadores de ruido ultrabajo para reducir el ruido electrónico.
    3. Si el RIN está limitado por el ruido de disparo y no por la fluctuación del láser, haga brillar más potencia óptica en el detector. Ver Figura 8.

3. Configuración de la detección espectral para imágenes SRS

1. Guíe la bomba y los haces stokes hasta el microscopio.
2. Coloque la muestra discutida en la sección 1 y busque una región sin cuentas para ayudar a alinear el haz de la bomba. Con una cámara, mida el perfil reflejado del haz Stokes (bomba) mientras bloquea la bomba (Stokes). Ajuste las posiciones de los puntos láser con los espejos justo antes del microscopio.
   NOTA: Para obtener la mayor generación de SRS, deben superponerse perfectamente. La Figura 9 muestra (A) la bomba, (B) Stokes y (C) ambos haces perfectamente superpuestos en el plano focal del microscopio.
3. Hacer confocales los objetivos de excitación y recolección.
   NOTA: El uso de objetivos corregidos al infinito significa que enfocar la bomba en el plano de muestra dará como resultado un haz colimado en la abertura posterior del objetivo de recolección.
   1. Coloque un filtro de paso corto para quitar los Stokes modulados y guíe el haz de la bomba hasta la rejilla. Coloque una lente después de la rejilla para enfocar el haz disperso en los detectores.
      NOTA: La ecuación de rejilla ayudará a determinar la dispersión lineal (es decir, cuántos nm por mm en el plano del detector con una lente de una distancia focal dada f³²). La ecuación de rejilla relaciona la periodicidad del surco d de la rejilla, el ángulo de incidencia α, el ángulo de difracción β, la longitud de onda difractada λ y el orden de difracción m (Eq [2]).
      (2)
4. Para una detección equilibrada, mida el espectro de la referencia y las réplicas de señal que se propagan a lo largo del haz de la bomba.
   NOTA: El perfil espacial del haz de la bomba después de la rejilla es una línea que comprende los diferentes componentes espectrales de la bomba de banda ancha a lo largo de su longitud. Cada componente espectral de la línea de bombeo se enfocará a la distancia f mediante una lente esférica (ver pasos 3.1-3.2).
   1. Para evitar recortar la bomba dispersa, coloque la lente esférica lo más cerca posible de la rejilla. Coloque un PBS justo después de la lente esférica para separar las réplicas de la bomba.
      NOTA: Aquí, se utilizó un divisor de haz de cubo polarizador porque este tipo de polarizador no codifica la polarización del haz de la bomba. También separa eficazmente las diferentes réplicas de la bomba y puede ser lo suficientemente grande como para evitar recortar la bomba de banda ancha. El PBS reflejará la réplica de señal (s-polarizada) y transmitirá la réplica de referencia (p-polarizada).
   2. Con un par de espejos de dirección, guíe la señal y la referencia a sus respectivos detectores (Figura 1).
      NOTA: En la configuración equilibrada ideal, las réplicas de señal y referencia deben tener la misma potencia óptica.
   3. Para eliminar el ruido en el haz de la bomba, correlacione los canales de la matriz de fotodiodos que miden la señal con sus contrapartes en el detector de referencia. Por lo tanto, asegúrese de que el^nº fotodiodo de las matrices de fotodiodos de señal y referencia mida la potencia óptica del mismo componente espectral de la señal y las réplicas de referencia.
      NOTA: La Figura 8 muestra espectros RIN ejemplares.
5. Para garantizar la coincidencia espectral entre las dos matrices de fotodiodos, coloque una pequeña hendidura o un iris entre la rejilla y el PBS para filtrar espacialmente la bomba dispersa. Recorte todos los componentes espectrales de las réplicas de la bomba excepto uno para centrar los rayos transmitidos en el^n-ésimo detector de las matrices de fotodiodos de referencia y señal. Utilice los espejos de dirección mencionados para ajustar la correlación de los diferentes canales de detección.
6. En este punto, inicie la microscopía SRS. Para hacer esto, module el Stokes, raster-scan la muestra, y adquiera la transferencia de modulación en el espectro de la bomba (ΔI) con su correspondiente espectro de CC (I) para obtener el espectro SRS normalizado (ΔI / I) de cada píxel. Producir matrices tridimensionales cuyas filas (x) y columnas (y) contengan las posiciones escaneadas de la muestra. En cada vector (z) ortogonal al plano x-y, almacene un espectro SRS.
   NOTA: La Figura 12 muestra la estructura de los datos hiperespectrales de SRS.
   1. Ajuste la potencia del haz Stokes a 65 mW y la del haz de la bomba de banda ancha a 20 mW. Establezca un tiempo de integración ideal para los experimentos.
      NOTA: Aquí, el tiempo de integración fue de 44 μs; sin embargo, el tiempo de permanencia de píxeles fue de 1 ms debido al lento escáner piezoeléctrico.

4. Quimiometría de datos SRS hiperespectrales

1. Utilice el análisis de resolución de curvas multivariantes para desenredar los diferentes componentes químicos de la muestra. Descargue la GUI desde el enlace en Tauler, de Juan y Jaumot³³.
   NOTA: Aquí, se utilizó el programa MATLAB Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) desarrollado por Tauler y sus compañeros de trabajo^34,35. Para aplicaciones de MCR-ALS a datos SRS, consulte ^36,37; para obtener información detallada sobre el algoritmo, consulte ³⁸.
2. En MATLAB, remodele el cubo de datos hiperespectrales srS en una matriz D con sus filas que contienen los espectros SRS. Supongamos que el hipercubo SRL desplegado D es una combinación lineal de la concentración C y los perfiles espectrales S de los constituyentes químicos de la muestra (es decir, D = CS ^T + E, donde E es una matriz que contiene el error experimental, y el superíndice ^T indica transposición de matriz).
3. Obtener los componentes principales de los datos para separar C y S. Como se sabe a priori que la muestra discutida en la sección 1 contiene cuatro especies, a saber, DMSO, Aceite de oliva, PMMA y PS, configuran el programa para buscar cuatro especies más otra para tener en cuenta el ruido de fondo. Si hay una muestra diferente con un número mayor o menor de especies, configure el programa en consecuencia.
   NOTA: El programa hace una descomposición de valor singular de los datos espectrales, usándolos como las conjeturas iniciales de los espectros puros S.
   1. Alternativamente, alimente el programa con una matriz que contenga los rastros espectrales conocidos (por ejemplo, los espectros Raman espontáneos de las sustancias).
      NOTA: Utilizando las estimaciones iniciales de los espectros puros, el programa calculará C = DS(S^TS)⁻1 y S^T = (C^TC)⁻¹C^TD. Los nuevos valores de C y S se optimizan con un algoritmo de mínimos cuadrados alternos.
4. Como SRS es una señal no negativa, restrinja el algoritmo de mínimos cuadrados alternos para entregar solo valores positivos.
   NOTA: Los optimizados C y S permitirán construir una nueva matriz D*= CS^T, un conjunto de datos que el programa comparará con los datos originales D. El programa itera automáticamente estos pasos hasta que la diferencia entre D* y D es menor que un valor de umbral arbitrario que se puede definir.
5. Trazar C y S para adquirir imágenes químicas y los espectros característicos de los constituyentes químicos de la muestra.

La Figura 3 muestra resultados ejemplares obtenidos utilizando este protocolo con PS, PMMA y aceite de oliva. Esta rotación de LBO1 cambiará el índice de refracción experimentado por el campo SHG, modificando directamente su velocidad de fase. Cuando la velocidad de fase del campo SHG coincide con la de la polarización no lineal inducida en LBO1, el campo no lineal generado y la polarización no lineal estarán en fase, lo que dará lugar a una intensa radiación SHG. En otras palabras, ajustar el ángulo de φ de LBO1 permitirá al usuario alcanzar la condición de coincidencia de fase ideal para SHG. Como aquí se utiliza un cristal de coincidencia de fase de tipo I, la polarización del haz SHG será ortogonal a la del haz fundamental (Figura 5B).

La Figura 8 muestra el RIN de las fuentes ópticas utilizadas en este protocolo y el límite de ruido de disparo, que es una consecuencia de la naturaleza cuántica de electrones y fotones que establece un límite fundamental para el ruido láser. El RIN limitado por ruido de disparo se calcula con como se muestra en Eq (3).

(3)

Donde h es la constante de Planck, y ν es la frecuencia óptica. Por lo tanto, el ruido de disparo proporciona pautas útiles para el diseño electrónico.

La Figura 11A y la Figura 11C muestran datos ejemplares de espectros equilibrados y desequilibrados. Naturalmente, los efectos de la detección equilibrada afectan los resultados finales de los experimentos, es decir, los mapas químicos. La Figura 11B y la Figura 11D muestran imágenes compuestas en condiciones desequilibradas y equilibradas, respectivamente. La implementación exitosa del protocolo descrito ayudará a identificar y localizar los diferentes componentes químicos de una muestra heterogénea y extraer sus espectros SRS característicos. Sometiendo los datos hiperespectrales de la Figura 12 al análisis quimiométrico se obtiene la Figura 13. La Figura 13A muestra un compuesto de los mapas de concentración de los diferentes constituyentes químicos de la muestra, mientras que la Figura 13B muestra sus espectros SRS característicos. Tenga en cuenta que los datos que se muestran en la Figura 13A no solo permiten al usuario identificar fácilmente los diferentes componentes de la muestra, sino también realizar un análisis más cuantitativo. Por ejemplo, utilizando los mapas de concentración, podríamos calcular la media de la concentración fraccional de cada especie química: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS y 22% Aceite de oliva.

Figura 1: Esquema del microscopio SRS de banda ancha empleado en este protocolo. Abreviaturas: PBSx = divisor de haz polarizador; SHG = segundo módulo de generación armónica; OPO = oscilador paramétrico óptico; AOM = modulador óptico acústico; SPF = filtro de paso corto; M-LIA: Amplificador de bloqueo multicanal; DM = espejo dicroico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Espectros de la bomba de banda ancha sintonizable (azul) y los haces Stokes de banda estrecha (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imagen de campo brillante de la muestra químicamente heterogénea. Tenga en cuenta que la microscopía convencional no permite distinguir los diferentes componentes. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: PS = poliestireno; PMMA = polimetacrilato de metilo; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Modulación de los pulsos de Stokes de banda estrecha. (A) La traza azul transparente muestra el haz difractado 0, mientras que el negro muestra el orden1º correspondiente. (B) Configuración óptica para optimizar la eficiencia de modulación del haz difractado de1er orden y el ajuste fino del tamaño del punto del haz stokes antes de llegar al objetivo de excitación. Abreviaturas: AOM = modulador óptico acústico; fx = distancia focal de la lente X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Procesos ópticos no lineales necesarios para impulsar el OPO. (A) Geometría de la interacción SHG. Dos fotones fundamentales en ω1 llevan el sistema material a un nivel virtual de alta energía, desde donde el sistema material salta al estado fundamental, emitiendo un fotón a ωSHG. (B) Esquema del experimento SHG. (C) Un esquema de las configuraciones SHG y OPO. (D) Geometría de la interacción DFG. Unfotón SHG ω se divide en fotones de señal (señal ω) y ralentí (ωIdler). Una ganancia del haz de señal se logra retroalimentando los fotones de señal y haciéndolos resonar en la cavidad. (E) Esquema del experimento DFG. Abreviaturas: SMx = espejo esférico (R = 75 mm); OPO = oscilador paramétrico óptico; SHG = segundo módulo de generación armónica; DFG = generación de diferencia-frecuencia; LBO = triborato de litio; OC = condensador de aceite; DM = espejo dicroico; fx = distancia focal de la lente X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Geometría del compresor del prisma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Generación de suma-frecuencia para optimizar la superposición espaciotemporal. (A) SFG entre la bomba y Stokes y su respectivo impacto SHG en una pantalla. Aquí, una lente enfocaba la bomba y los haces stokes en el cristal, mientras que un filtro de paso bajo los eliminaba. (B) Intensidad del SFG entre la bomba y Stokes en función del retardo de tiempo. Establezca el tiempo cero de la configuración del SRS en la posición que maximiza el SFG. La asimetría de la correlación cruzada en B se debe al perfil temporal causado por el etalón en el haz de Stokes. Abreviaturas: SFG = suma-generación de frecuencias; SHG = segundo módulo de generación armónica; SRS = espectroscopia de dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Espectros RIN. La banda resaltada en verde muestra la mejor región espectral para los experimentos SRS. La modulación del haz de Stokes a cualquier frecuencia dentro de esta banda garantiza que los efectos del ruido láser en la señal SRS serán los más bajos posibles. Abreviaturas: RIN = ruido de intensidad relativa; SRS = espectroscopia de dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Perfiles de vigas. (A) Bomba, (B) Stokes, y (C) bomba y Stokes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Geometría asumida para una rejilla de dispersión y un detector de matriz de fotodiodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11. Los efectos de la detección equilibrada. Efectos sobre espectros (A, C) e imágenes químicas (B, D). Los compuestos que se muestran en los paneles (B) y (D) son los resultados finales de los experimentos (es decir, después del análisis quimiométrico de datos hiperespectrales. Consulte la sección 4 del protocolo para obtener más información). Barras de escala = 10 μm. Abreviatura: SRS = espectroscopia de dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Un hipercubo SRS representativo adquirido con microscopía SRS de banda ancha. El plano x-y almacena las coordenadas de las posiciones escaneadas, mientras que cada vector a lo largo de z registra un espectro SRS. Abreviatura: SRS = espectroscopia de dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: Análisis quimiométrico de datos de SRS hiperespectrales. (A) Compuesto de los mapas de concentración de los diferentes constituyentes de la muestra. (B) Espectros característicos de la especie química. En ambos paneles, amarillo: aceite de oliva, azul: DMSO, cian: PS, y naranja: PMMA. Barra de escala = 20 μm (A). Abreviaturas: SRS = espectroscopia de dispersión Raman estimulada; PS = poliestireno; PMMA = polimetacrilato de metilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

G. C. declara su participación en la empresa Cambridge Raman Imaging, que tiene como objetivo comercializar la tecnología de microscopía SRS de banda ancha. Los otros autores declaran no tener conflictos de intereses.