Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Summary

Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.

Abstract

Comprender la homeostasis de proteínas in vivo es clave para saber cómo funcionan las células tanto en condiciones fisiológicas como de enfermedad. El presente protocolo describe el etiquetado in vivo y la posterior purificación de proteínas recién sintetizadas utilizando una línea de ratón diseñada para dirigir el etiquetado de proteínas a poblaciones celulares específicas. Es una línea inducible por la expresión de Cre recombinasa de L274G-Metionina ARNt sintetasa (MetRS*), lo que permite la incorporación de azidonorleucina (ANL) a las proteínas, que de otro modo no ocurrirá. Utilizando el método descrito aquí, es posible purificar proteomas específicos de tipo celular marcados in vivo y detectar cambios sutiles en el contenido de proteínas debido a la reducción de la complejidad de la muestra.

Introduction

La homeostasis aberrante de proteínas es causada por un desequilibrio en la síntesis y degradación de proteínas. Varias enfermedades están relacionadas con alteraciones en la homeostasis de proteínas. El sello distintivo de algunas enfermedades es la presencia de agregados en diferentes ubicaciones subcelulares y áreas cerebrales. La homeostasis proteica no sólo es importante en la enfermedad, sino que también desempeña un papel crucial en la función normal de los órganos y las células¹. Por ejemplo, la síntesis de proteínas es necesaria para muchas formas de plasticidad neuronal^2,3, de....

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron con permiso de las oficinas gubernamentales locales en Alemania (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o España (Comité de Experimentación Animal de la UCM y Consejería Ambiental de la Comunidad de Madrid, número de protocolo: PROEX 005.0/21) y cumplen con las normas de la Sociedad Max Planck y la normativa española y siguen las directrices de la UE para el bienestar animal.

1. Etiquetado metabólico in vivo con ANL

1. Agua potable:
   1. Disuelva ANL y maltosa en el agua potable regular de los ratones. La concentración de ma....

Results

Siguiendo el protocolo descrito (resumido en la Figura 1), se administró ANL a ratones mediante inyecciones intraperitoneales diarias (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) durante 7 días, o a través de agua potable (0,7% maltosa, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) durante 21 días. Después del etiquetado, las áreas cerebrales correspondientes fueron diseccionadas, lisadas, alquiladas y clicadas. Las reacciones de clic fueron analizadas por SDS-PAGE y Western Immunoblot. L.......

Discussion

Los aspectos críticos del protocolo son; la inclusión de controles negativos, tener suficientes réplicas biológicas, la vía de administración de ANL, la cantidad y la duración, la alquilación de las muestras, la concentración de alquinos y la eliminación de β-mercaptoetanol cuando se usa DST-alquino.

Es clave incluir muestras de control negativo procedentes de animales marcados con ANL sin conductor Cre y, por lo tanto, sin expresión de MetRS*. Estas muestras deben someterse a todos los pasos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Geles de acrilamida	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Tóxico; utilice una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora.
Bicarbonato de amonio	Sigma	9830	Tóxico; use una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora
ANL			Sintetizado como se describió anteriormente para AHA (ver referencias 5 y 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonase	Sigma	E1014
Biotina alquino	Thermo,B10185
Anticuerpo de pollo anti-GFP	Aves	1020
Inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA	Roche	4693132001	Toxic; utilice una bata de laboratorio y guantes.
Bromuro de cobre (I)	Sigma	254185	99,999% (peso/peso)
Marcador de disulfuro (DST)-alquino			sintetizado según lo informado en el número de referencia 15, en el que se hace referencia a él como sonda 20
Filtros DMSO	Sigma 276855
	Merk	SCGP00525
Acetamida de yodo (IAA)	Sigma	I1149
IR anti pollo 800	LI-COR	IRDye 800CW	Burro anti-Pollo Anticuerpo Secundario
IR anti rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Cabra anti-Conejo IgG Anticuerpo Secundario
Maltose	Sigma	M9171
Mezclador Manual	BioSpec Productos	1083
NaCl	Sigma	S9888
N-etilmaleimida	Sigma	4259	Nocivo; Use una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora.
Perlas de NeutrAvidin	Pierce	29200
Membrana de nitrocelulosa	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7.8			Preparación descrita en el número de referencia 5
Columnas PD SpinTrap G-25 GE	Healthcare		Intercambio de tampones
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo,	23225	Los reactivos del kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce son tóxicos para la vida acuática.
Anticuerpo policlonal anti-biotina	de conejo Cell Signaling	5597
Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Tampón de funcionamiento MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Tinción de rubí	Sigma	S4942
Mesa automática Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Ligando triazol Sigma		678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Sigma de agua		W4502	Grado de biología molecular