Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF

Shawn W. Schowe; Conner J. Langeberg; Erich G. Chapman; Kitty Brown; Marino  J. E. Resendiz

doi:10.3791/63720

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Artículo de método

Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF

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DOI:

10.3791/63720

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11 de abril de 2022

Shawn W. Schowe¹ , Conner J. Langeberg² , Erich G. Chapman² , Kitty Brown³ , Marino J. E. Resendiz¹

¹Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, ²Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, ³Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

En este artículo

Resumen

MALDI-TOF se utilizó para caracterizar fragmentos obtenidos de la reactividad entre el ARN oxidado y la exoribonucleasa Xrn-1. El presente protocolo describe una metodología que puede aplicarse a otros procesos que involucran ARN y/o ADN.

Resumen

El ARN es un biopolímero presente en todos los dominios de la vida, y sus interacciones con otras moléculas y / o especies reactivas, por ejemplo, ADN, proteínas, iones, medicamentos y radicales libres, son omnipresentes. Como resultado, el ARN sufre varias reacciones que incluyen su escisión, degradación o modificación, lo que lleva a especies biológicamente relevantes con distintas funciones e implicaciones. Un ejemplo es la oxidación de la guanina a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que puede ocurrir en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS). En general, los procedimientos que caracterizan tales productos y transformaciones son en gran medida valiosos para la comunidad científica. Con este fin, la espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un método ampliamente utilizado. El presente protocolo describe cómo caracterizar los fragmentos de ARN formados después del tratamiento enzimático. El modelo elegido utiliza una reacción entre el ARN y la exoribonucleasa Xrn-1, donde la digestión enzimática se detiene en los sitios oxidados. Dos secuencias largas de ARN de 20 nucleótidos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida, cuantificadas por espectroscopia UV-vis, y caracterizadas mediante MALDI-TOF. Las hebras obtenidas fueron entonces (1) 5'-fosforiladas y caracterizadas vía MALDI-TOF; (2) tratado con Xrn-1; (3) filtrado y desalinizado; (4) analizado vía MALDI-TOF. Esta configuración experimental condujo a la identificación inequívoca de los fragmentos asociados con el estancamiento de Xrn-1: [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5'-H₂PO₄-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Los experimentos descritos se llevaron a cabo con 200 picomoles de ARN (20 pmol utilizados para los análisis MALDI); sin embargo, cantidades más bajas pueden resultar en picos detectables con espectrómetros que utilizan fuentes láser con más potencia que la utilizada en este trabajo. Es importante destacar que la metodología descrita puede generalizarse y potencialmente extenderse a la identificación de productos para otros procesos que involucran ARN y ADN, y puede ayudar en la caracterización / elucidación de otras vías bioquímicas.

Introducción

MALDI-TOF ^1,2,3 es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización y/o detección de moléculas de diferentes tamaños y características. Algunos de sus usos incluyen diversas aplicaciones como la detección de taninos de recursos naturales⁴, la obtención de imágenes de metabolitos en alimentos⁵, el descubrimiento o monitoreo de dianas o marcadores celulares de fármacos⁶, y el diagnóstico clínico⁷, por nombrar algunos. De relevancia para el presente trabajo es el uso de MALDI....