Utilización de baja tensión de oxígeno para reducir las células hematopoyéticas en cultivos de células estromales de médula ósea murina

Resumen

Un cultivo rutinario de células estromales de médula ósea (BMSC) conduce al aislamiento de poblaciones celulares heterogéneas, muchas de las cuales son de origen hematopoyético. Aquí, describimos un método que utiliza baja tensión de oxígeno para reducir en gran medida los contaminantes hematopoyéticos en cultivos murinos de BMSC.

Resumen

En la actualidad, sigue habiendo una falta de marcadores universalmente aceptados para aislar prospectivamente una población homogénea de células madre esqueléticas (SSC). Por esta razón, las BMSC, que apoyan la hematopoyesis y contribuyen a todas las funciones del esqueleto, continúan siendo ampliamente utilizadas para estudiar progenitores mesenquimales multipotentes (MMP) y para inferir la función de las SSC. Además, dada la amplitud de los modelos murinos transgénicos utilizados para estudiar las enfermedades musculoesqueléticas, el uso de las BMSC también sirve como una poderosa herramienta para examinar los mecanismos moleculares que regulan las MMP y las SSC. Sin embargo, los procedimientos de aislamiento comunes para las BMSC murinos dan como resultado que más del 50% de las células recuperadas sean de origen hematopoyético, lo que podría dificultar la interpretación de los datos generados durante estos estudios. En este trabajo describimos un método que utiliza baja tensión de oxígeno o hipoxia para la eliminación selectiva de células CD45⁺ en cultivos de BMSC. Es importante destacar que este método se puede implementar fácilmente no solo para reducir los contaminantes hemopoyéticos, sino también para aumentar el porcentaje de MMP y SSC putativas en los cultivos de BMSC.

Introducción

Al igual que las células madre hematopoyéticas (HSC), las SSC se alojan dentro del microambiente óseo; sin embargo, a diferencia de las HSCs, actualmente hay una falta de marcadores de superficie celular universalmente aceptados que puedan ser utilizados para identificar prospectivamente las SSCs ^1,2,3. Sin embargo, los sistemas de cultivo in vitro y los ensayos de reconstitución in vivo demuestran que una proporción de BMSCs tienen la capacidad de soportar la hematopoyesis, así como la capacidad de diferenciarse en todas la....

Protocolo

Todos los métodos descritos, utilizando modelos murinos, se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (A187-19-08).

1. Disección de los huesos de las extremidades posteriores

1. Eutanasia de ratones C57BL/6 machos o hembras de 10-12 semanas de edad mediante asfixia por CO₂ utilizando un caudal de 2-4 L/min seguido de la confirmación de la muerte por decapitación. En este ensayo se pueden utilizar ratones hembra o macho sin que se esperen diferencias en los resultados. Rocíe la piel con etanol al 70....

Resultados

Después de 7 días de aislamiento celular, las células cultivadas al 21% de oxígeno son muy heterogéneas. Específicamente, hay una gran variación en el tamaño, con células bipolares más grandes interespaciadas con células más pequeñas que contienen múltiples protuberancias (Figura 1A). Por el contrario, las células cultivadas en condiciones hipóxicas son muy homogéneas. Las células dentro de las colonias son relativamente similares en tamaño y tienen una apariencia bipolar, que se asemeja a o.......

Discusión

Con base en nuestras observaciones, las BMSCs se adhieren al plástico de cultivo de tejidos antes que los macrófagos y otras células de origen hemopoyético¹¹. Por esta razón, el enjuague de las placas 3 h después del enchapado es un paso crítico, ya que elimina las células hematopoyéticas flotantes que tienen el potencial de adherirse a puntos de tiempo posteriores. Además, estos enjuagues deben realizarse con cuidado, específicamente pipeteando los medios en el c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de tejidos de 100 mm2	Corning	353003
1x solución salina pulida con fosfato (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocitómetro	Sigma-Aldrich Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (EE. UU.), Caracterizado	Healthcare Life Ciencias	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleósidos	Gibco	12571-063
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Tampón de lisado de glóbulos rojos Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  matraces para cultivo de tejidos	Corning	430168
Solución Azul de Tripano	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Gibco	25200-056

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