La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na⁺ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

El sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es la principal vía que impulsa la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP), la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consumo de equivalentes reductores, como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o succinato, por parte de las mitocondrias. El sistema OXPHOS se compone de cinco complejos de proteínas: el Complejo I (CI) oxida el NADH y reduce la CoQ en ubiquinol (CoQH₂). El Complejo II (CII) oxida el succinato en fumarato y reduce la CoQ en CoQH₂. El Complejo III (CIII) oxida la CoQH₂ de nuevo en CoQ, reduciendo el citocromo c (cyt c). Finalmente, el complejo IV (CIV) oxida el citt c y reduce el oxígeno al agua. Esta cadena de oxidorreducción, la llamada cadena de transporte de electrones (mETC), está acoplada al bombeo de H ⁺ a través de la IMM, lo que crea un gradiente electroquímico utilizado por el complejo V (CV) para fosforilar el difosfato de adenosina (ADP) en ATP.

Los complejos mETC pueden estar solos en el IMM o ensamblarse en estructuras cuaternarias llamadas supercomplejos. El CIV puede ensamblarse con CIII, formando el III₂+IV o Q-respirasoma (ya que es capaz de respirar en presencia de CoQH₂)^1,2,3 o formando homodímeros u homooligomeros⁴. CIII puede interactuar con CI, formando el supercomplejo I+III₂⁵. Finalmente, CI también es capaz de interactuar con el Q-respirasoma, construyendo el I+III₂+IV o N-respirasoma (ya que puede respirar consumiendo NADH)^1,6,7,8,9,10.

CoQ y cyt c son portadores de electrones móviles encargados de transferir electrones de CI/CII a CIII, y de CIII a CIV, respectivamente. Si los supercomplejos imponen o no una restricción local funcional para estos portadores ha sido un tema de intenso debate a lo largo de las últimas dos décadas ^{2,7,11,12,13,14,15,16,17}. Sin embargo, varios grupos independientes han demostrado que coQ y cyt c se pueden segmentar funcionalmente en grupos en el IMM. Con respecto a la CoQ, se puede segmentar funcionalmente en una agrupación específica de CoQ para IC (CoQ^NAD) y otra agrupación dedicada a enzimas dependientes de FAD (CoQ^FAD)1,7,12,18,19. Sin embargo, para diferenciar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados, se requirió la sobreexpresión de la oxidasa alternativa (AOX) y la generación de mutantes específicos de ADNmt, que pueden ensamblar IC en ausencia de CIII, ^1,19,20.

El mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la hipoxia era desconocido hasta hace poco. Ante la hipoxia aguda, IC sufre la transición activa/deactiva (A/D), que implica la disminución de su actividad de bombeo H⁺ NADH-CoQ oxidorreductasa. Tal disminución en el bombeo de H ⁺ acidifica la matriz mitocondrial y disuelve parcialmente los precipitados de calcio-fosfato en la matriz mitocondrial, liberando Ca^{2 +} soluble. Este aumento de Ca²⁺ soluble activa el intercambiador Na⁺/Ca²⁺ (NCLX), que extruye Ca²⁺ a cambio de Na⁺. El aumento de Na⁺ mitocondrial interactúa con los fosfolípidos en el lado interno de la IMM, disminuyendo su fluidez y transferencia de CoQ entre CII y CIII, produciendo finalmente anión superóxido, una señal redox²¹. Curiosamente, la transferencia de CoQ solo disminuyó entre CII y CIII, pero no entre IC y CIII, destacando que 1) Na⁺ fue capaz de modular solo uno de los grupos de CoQ existentes en las mitocondrias; 2) existen grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM. Por lo tanto, se puede utilizar un protocolo ampliamente utilizado para el estudio de las actividades enzimáticas mitocondriales para evaluar la existencia de las piscinas de CoQ mencionadas.

El protocolo actual se basa en la medición de la reducción de la cit c oxidada, el sustrato de CIII, por absorbancia en presencia de succinato (es decir, sustrato CII) o NADH (es decir, sustrato CI). La misma muestra se divide en dos, una de las cuales será tratada con KCl, y la otra con la misma concentración de NaCl. De esta manera, dado que el Na⁺ disminuye la fluidez de la IMM, si la CoQ existiera en un pool único en la IMM, tanto la CI+CIII como la CII+CIII disminuirían en presencia de Na⁺. Sin embargo, si la CoQ existiera en grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados, el efecto de Na⁺ sería mayormente (o sólo) evidente en la actividad de CII+CIII, pero no en la CI+CIII. Como se publicó recientemente²¹, na⁺ solo afecta la transferencia de CoQ entre CII y CIII (Figura 1C,D), pero no entre IC y CIII (Figura 1A,B).

Este protocolo, junto con una panoplia de técnicas, se ha utilizado para confirmar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados en el IMM, uno dedicado a CI (es decir, CoQ^NAD) y otro dedicado a enzimas ligadas a FAD (es decir, CoQ^FAD)^1,3,7; una observación que, aunque se sigue debatiendo²², ha sido corroborada de forma independiente por varios grupos ^7,19. Así, el superasamblaje de IC en supercomplejos impacta en la movilidad local de CoQ, facilitando su uso por el CIII dentro del supercomplejo 1,7,13,14,23,24,25.

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), España, de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y con el Real Decreto español de 1 de febrero de 2013 (53/2013). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.

NOTA: Este ensayo comparativo para estudiar la segmentación de las piscinas de CoQ mitocondrial se describe de la siguiente manera:

1. Cuantificación de proteínas

1. Congelar y descongelar las mitocondrias aisladas²⁶ de un hígado de ratón de tipo salvaje tres veces (es decir, membranas mitocondriales) antes de la experimentación para hacer que los orgánulos sean permeables a los sustratos de reacción.
2. Cuantificar la cantidad de proteína de la muestra de mitocondrias aisladas mediante métodos de Bradford o ácido bicinconinico (BCA). En el caso de Bradford, agregue 2 μL de muestra en 1 ml de 1x reactivo de Bradford.
3. Divida la muestra en cuatro submuestras de 20 μg cada una (a saber: A, B, C, D; Figura 2A).

2. Medición de la actividad DE CI+CIII

NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras A y B para medir la actividad de CI+CIII (Figura 2B).

1. Divida las muestras A y B en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, A1, A2, B1 y B2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 10 μL de malonato de 100 ml y agregue tampón C1/C2 precalentado (Tabla 1) a 37 °C hasta 980 μL (979 μL para cubetas A2 y B2).
   PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos malonato y cianuro de potasio.
   NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K₂HPO₄ , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento.
2. Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas A1 y A2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas B1 y B2.
3. Añadir 1 μL de rotenona de 1 mM en la cubeta que contiene las submuestras A2 y B2.
   PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico rotenona.
4. Justo antes de la medición, agregue 10 μL de NADH (10 mM) en todas las cubetas.
   NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar.
5. Mezcle la cubeta volteándola cuidadosamente tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VISJASCO).
6. Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 minutos de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.
7. Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.

3. Medición de la actividad CII+CIII

NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras C y D para medir la actividad de CII+CIII (Figura 2C).

1. Divida las muestras C y D en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, C1, C2, D1 y D2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 1 μL de rotenona de 1 mM y agregue tampón C1/C2 precalentado a 37 °C hasta 980 μL (970 μL para cubetas C2 y D2).
   PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos cianuro de potasio y rotenona.
   NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K₂HPO₄ , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento.
2. Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas C1 y C2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas D1 y D2.
3. Añadir 1 μL de 1 mM de antimicina A en la cubeta que contiene las submuestras C2 y D2.
   PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico antimicina A.
4. Justo antes de la medición, agregue 10 μL de succinato (1 M) en todas las cubetas.
   NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar.
5. Mezcle la cubeta con cuidado, volteándola tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VIS).
6. Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 min de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.
7. Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.

Los resultados típicos de este protocolo se representan a continuación (Figura 3). Como la absorbancia reducida de cyt c se localiza en 550 nm, todas las submuestras desinhibidas deben mostrar un aumento en la absorbancia a 550 nm. Las submuestras inhibidas muestran idealmente una pendiente de línea plana o ligeramente creciente (Figura 3). Las pendientes de las submuestras inhibidas deben restarse de las submuestras desinhibidas.

Las muestras A y B, ambas corregidas por su correspondiente inhibición y que representan la actividad de la OXidorreductasa NADH:cyt c, tienen una pendiente similar (Figura 3A). Sin embargo, las submuestras C y D, ambas corregidas por su correspondiente inhibición y que representan la actividad de la oxidorreductasa de succinato:cyt c, son diferentes, en el sentido de que la actividad de la submuestra C es mayor que la actividad de la submuestra D (Figura 3B). Tenga en cuenta que la absorbancia basal puede ser ligeramente diferente entre las muestras (Figura 3A).

Estos resultados (es decir, pendientes ya corregidas por su inhibidor; Tabla 2) se puede representar dividiendo la cantidad de proteína utilizada (0,01 mg) como a.u./min/mg de proteína. A partir de este valor, la tasa de reducción de cyt c se puede calcular aún más utilizando la ley lamber-beer21.

Es importante destacar que estos resultados pueden variar según varios factores: (i) Origen de las muestras. Dado que los diferentes tejidos y tipos de células tienen una composición variable de complejos y supercomplejos OXPHOS, los valores absolutos y los cambios relativos pueden variar entre las muestras. (ii) Dado que diferentes tejidos pueden tener una composición variable de complejos OXPHOS y supercomplejos, agregar más mitocondrias congeladas-descongeladas (para compensar valores absolutos más bajos de un determinado tejido) a la mezcla de reacción puede tener un efecto secundario, que es que la proporción de Na+ o K+ por mg de proteína/fosfolípido en la muestra disminuya. Por lo tanto, se debe tener precaución al variar la cantidad de mitocondrias o la concentración de Na +/ K + agregada a la muestra. (iii) La variación interexperimental puede surgir de la duración y la temperatura de los ciclos de congelación-descongelación, los reactivos del lote comercial o el almacenamiento variable de las mitocondrias aisladas.

Figura 1: Na+ disminuye específicamente la transferencia de electrones entre CII y CIII, pero no entre CI y CIII. (A) Representación esquemática de la transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través del CoQNAD en el supercomplejo I + III2. (B) La transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través del CoQNAD en el supercomplejo I + III2, no se ve afectada por El Na + intramitocondrial. (C) Representación esquemática de la transferencia de electrones entre el succinato y el cyt c, que ocurre a través delCOQ FAD en CII. (D) La transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través delCOQ FAD en el supercomplejo I + III2, disminuye por Na + intramitocondrial alto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática del protocolo desde la subdivisión de la muestra original hasta la medición cinética. (A) Representación esquemática de la división submuestra, destacando el mismo origen de todas las submuestras. (B) Esquema de las etapas sucesivas de las adiciones de reactivos para la actividad CI+CIII en las submuestras A1 y B1. El círculo rojo representa la ubicación donde idealmente se debe agregar NADH. Tenga en cuenta que la única diferencia con las submuestras A2 y B2 es la adición adicional de rotenona en esta última. (C) Esquema de las sucesivas etapas de las adiciones de reactivos para la actividad CII+CIII en las submuestras C1 y D1. El círculo rojo representa la ubicación donde idealmente se debe agregar succinato. Tenga en cuenta que la única diferencia con las submuestras C2 y D2 es la adición adicional de antimicina A en esta última. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efecto de Na+ en la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales hepáticas del ratón sobre NADH o adición de succinato. (A) Trazas representativas que muestran el efecto del Na+ sobre la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales hepáticas del ratón que oxidan el NADH. (B) Trazas representativas que muestran el efecto del Na+ sobre la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales del hígado de ratón oxidando el succinato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición del tampón C1/C2. La composición del tampón se presenta en concentraciones molares.

Cuadro 2: Rangos de tasas esperadas. Los valores esperados para cada actividad se presentan en unidades arbitrarias. También se presenta la prueba estadística correspondiente entre +KCl y +NaCl. "n" representa el número de réplicas.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.