Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados
En este artículo
Resumen
Resumen
Las piscinas de ubiquinona (CoQ) en la membrana mitocondrial interna (IMM) están parcialmente segmentadas en enzimas complejas I o dependientes de FAD. Dicha subdivisión puede evaluarse fácilmente mediante un ensayo comparativo utilizando NADH o succinato como donantes de electrones en mitocondrias congeladas-descongeladas, en las que se mide la reducción del citocromo c (cyt c). El ensayo se basa en el efecto de Na+ sobre el IMM, disminuyendo su fluidez. Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa y las actividades de la succinato-cyt c oxidorreductasa en presencia de NaCl o KCl. Las reacciones, que se basan en la mezcla de reactivos en una cubeta de manera escalonada, se miden espectrofotométricamente durante 4 min en presencia de Na+ o K+. La misma mezcla se realiza en paralelo en presencia de inhibidores enzimáticos específicos para restar el cambio inespecífico en la absorbancia. La actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa no disminuye en presencia de ninguno de estos cationes. Sin embargo, la actividad de la oxidorreductasa de succinato-cyt c disminuye en presencia de NaCl. Este sencillo experimento destaca: 1) el efecto del Na+ en la disminución de la fluidez de la IMM y la transferencia de CoQ; 2) que el supercomplejo I + III2 protege la transferencia de ubiquinona (CoQ) de verse afectada por la disminución de la fluidez de IMM; 3) que la transferencia de CoQ entre IC y CIII es funcionalmente diferente de la transferencia de CoQ entre CII y CIII. Estos hechos apoyan la existencia de grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM y muestran que pueden ser regulados por el entorno cambiante de Na + de las mitocondrias.
Introducción
El sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es la principal vía que impulsa la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP), la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consumo de equivalentes reductores, como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o succinato, por parte de las mitocondrias. El sistema OXPHOS se compone de cinco complejos de proteínas: el Complejo I (CI) oxida el NADH y reduce la CoQ en ubiquinol (CoQH2). El Complejo II (CII) oxida el succinato en fumarato y reduce la CoQ en CoQH2. El Complejo III (CIII) oxida la CoQH2 de nuevo en CoQ, reduciendo el citocromo c (cyt c). Finalmente, el compl....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), España, de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y con el Real Decreto español de 1 de febrero de 2013 (53/2013). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.
NOTA: Este ensayo comparativo para estudiar la segmentación de las piscinas de CoQ mitocondrial se describe de la siguiente manera:
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los resultados típicos de este protocolo se representan a continuación (Figura 3). Como la absorbancia reducida de cyt c se localiza en 550 nm, todas las submuestras desinhibidas deben mostrar un aumento en la absorbancia a 550 nm. Las submuestras inhibidas muestran idealmente una pendiente de línea plana o ligeramente creciente (Figura 3). Las pendientes de las submuestras inhibidas deben restarse de las submuestras desinhibidas.
Las.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aunque este protocolo representa un procedimiento muy sencillo para identificar la existencia de los grupos de CoQ parcialmente segmentados, hay algunos pasos críticos a tener en cuenta. Los sustratos (es decir, NADH o succinato) se agregan preferiblemente en último lugar, ya que puede ocurrir la autooxidación de estos compuestos. El volteo de cuvette debe ser cuidadoso para evitar la formación de burbujas que puedan interferir con la lectura.
Además, la presente técnica presenta algunas limit.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernández, A., al Dr. C. Jiménez y al E. R. Martínez-Jiménez por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por MICIN: RTI2018-099357-B-I00 y HFSP (RGP0016/2018). El CNIC cuenta con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 creada con BioRender.com.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford | de proteínas Bio-Rad | 5000001 | |
| Citocromo c del corazón equino | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Ácido malónico | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Cianuro de potasio | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Software Spectra Manager | JASCO | versión 2 | |
| Espectrofotómetro | UV/VISJASCO | ||
| Succinato | Sigma-Aldrich | 398055 |
Referencias
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory superc....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
