Artículo de método

Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

DOI:

10.3791/63733

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6 de abril de 2022

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1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

En este artículo

Resumen

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La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

Resumen

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Las imágenes intravitales de las interacciones leucocitarios-endoteliales ofrecen información valiosa sobre la enfermedad inmunomediada en animales vivos. El estudio de la lesión pulmonar aguda (ALI) / síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y otras patologías respiratorias in vivo es difícil debido a la accesibilidad limitada y los artefactos de movimiento inherentes de los pulmones. No obstante, se han desarrollado varios enfoques para superar estos desafíos. Este protocolo describe un método para la microscopía de fluorescencia intravital para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales en tiempo real en la microcirculación pulmonar en un modelo experimental de ALI. Se utiliza un sistema de imágenes pulmonares in vivo y una plataforma de microscopía intravital impresa en 3D para asegurar el ratón anestesiado y estabilizar el pulmón al tiempo que minimiza la lesión pulmonar confusa. Después de la preparación, la microscopía de fluorescencia de campo ancho se utiliza para estudiar la adhesión de leucocitos, el laminado de leucocitos y la función capilar. Si bien el protocolo presentado aquí se centra en la obtención de imágenes en un modelo agudo de enfermedad pulmonar inflamatoria, también puede adaptarse para estudiar otros procesos patológicos y fisiológicos en el pulmón.

Introducción

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La microscopía intravital (IVM) es una herramienta de imagen útil para visualizar y estudiar diversos procesos biofísicos in vivo. El pulmón es muy difícil de obtener imágenes in vivo debido a su ubicación cerrada, la naturaleza frágil de su tejido y los artefactos de movimiento inducidos por la respiración y los latidos del corazón 1,2. Se han desarrollado varias configuraciones de microscopía intravital (IVM) para obtener imágenes en tiempo real de las interacciones leucocitarios-endoteliales en la microcirculación pulmonar para superar estos desafíos. Tales enfoques se basan en exponer qui....

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Protocolo

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Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron con la aprobación previa del Comité de Animales de Laboratorio de la Universidad de Dalhousie (UCLA).

1. Preparación

  1. Sistema de imágenes pulmonares: Para preparar la ventana, administre una capa delgada de grasa al vacío en la parte superior del anillo exterior mientras evita la contaminación del canal de vacío. Coloque una cubierta de vidrio limpia de 8 mm en la ventana y presione suavemente hacia abajo para crear un sello.
  2. Microscopio de fluorescencia de campo ancho: realice imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo ancho convencional eq....

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Resultados

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Para ilustrar los resultados alcanzables a través de este protocolo, la lesión pulmonar aguda (ALI) se indujo 6 h antes de la obtención de imágenes utilizando un modelo de instilación de lipopolisacáridos bacterianos intranasales (LPS). Brevemente, los ratones (n = 3) fueron anestesiados con isoflurano, y pequeñas gotas de LPS de Pseudomonas aeruginosa en solución salina estéril (10 mg/ml) se pipetearon en el naris izquierdo a una dosis de 5 mg/kg. Esto se comparó con ratones ingenuos (n = 3; sin administración .......

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Discusión

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El protocolo presentado aquí requiere práctica y atención a algunos pasos críticos. Primero, es importante preparar la ventana de imágenes antes de iniciar la intubación y la cirugía. Use una cantidad mínima de grasa al vacío para recubrir el anillo exterior de la ventana de imágenes, aplique el vidrio de la cubierta y pruebe la succión con una gota de agua destilada. Preparar esto con anticipación evitará que el pulmón expuesto se seque durante la configuración, de lo contrario. Si bien es posible enjuagar con solución .......

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Divulgaciones

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Kamala D. Patel es la presidenta y cofundadora de Luxidea, la empresa a la que se compró la ventana de imágenes utilizada en este experimento.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer al Dr. Pina Colarusso, quien proporcionó una experiencia significativa en la edición y revisión de este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL BD Luer Jeringa de punta deslizante estéril, de un solo usoBecton, Dickinson and Company309659Jeringa de 1 mL
Pinzas de apósito ADSON, ancho de la punta 0,6 mm, longitud de los dientes 11,5 mm, 12 cmRWD Life Science Co.F12002-12Pinzas romas
Albúmina-Fluoresceína IsotiocianatoSigma-AldrichA9771-1GFITC-Albúmina
Alcohol Isopropílico Alcohol 70% v/vCanadian Custom Packaging Company80002455Toallita con alcohol
AVDC110 Convertidor de vídeo digital avanzadoCanopus00631069602029Convertidor de vídeo digital
B/N - CCD - Imágenesbocina de cámaraBC-71Cámara
Bovie Deluxe Kit de cauterización de alta temperaturaFine Science Tools18010-00Cauterizador
C57BL/6 RatonesCharles River Laboratories InternationalC57BL/6NCrlC57BL/6
Ratones Aplicadores con punta de algodónPuritan806-WCAplicador
de algodón CS-8R 8mm Cubreobjetos de vidrio redondoWarner Instruments64-0701Cubreobjetos de vidrio
Manómetro digitalITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM& VManómetro digital
Dr Mom Otoscopio LED inoxidable delgado Otoscopio. Mom Otoscopio1001Otoscopio
Ethyl Alchohol 95% VolAlcoholes comercialesP016EA9595% etanol
Tijeras finas - Acero inoxidable martensíticoHerramientas de ciencia fina14094-11Tijeras
Fisherbrand Cinta de etiquetado de coloresFisher Scientific1590110Cinta de etiquetado
Gast DOA-P704-AA Bomba de vacío de alta capacidadCole-Parmer Canada CompanyZA-07061-40 Bomba devacío
Hartman HemostatsFine Science Tools13003-10Pinzas hemostáticas
Grasa de alto vacíoDow CorningDC976VFGrasa de vacío
Isoflurano USPFresenius KabiCP0406V2Isoflurano
LIDOcaína Inyección de HCl 1% 50 mg/5 mLTeligent Canada0121AD01Lidocaína HCl 1%
Lung SurgiBoardLuxidea, Inc.IMCH-0001Diseñado para la microscopía intravital del pulmón
Aceite mineralTeva Canadá00485802Aceite mineral
Ratón Kit de intubación endotraquealKent Scientific CorporationETI-MSESoporte de intubación, máscara de anestesia, cánula endotraqueal de 20 G, cable de fibra óptica
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Original Prusa i3 MK3S+ Impresora 3DPrusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEI
Oxígeno, ComprimidoLinde Canada Inc.Oxígeno
PrecisiónAguja Glide 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm)Becton, Dickinson and Company305106Aguja de 30 G
Pyrex 5340-2L 5340 Matraces filtrantes, 2000 mLCole-Parmer Canada Company5340-2LMatraz de vacío
Rodamina 6 GSigma-Aldrich252433Rhodamine 6G
Cinta Médica de Tela Suave Segura - 3"PrimadaPM5-630709Cinta de tela
Silastic Tubo de grado médico .040 pulg. ID x .085 pulg. ODDow Corning602-205Tubo de polietileno de 1,0 mm de diámetro interno
Sistema de anestesia de bajo flujo SomnosuiteScientific CorporationSS-01, módulo SS-04Ventilador para roedores pequeños, Sistema de anestesia de bajo flujo, Almohadilla térmica, Sonda de temperatura rectal, Oxímetro de pulso
Pinzas de tejido, 12,5 cm de largo, curvos, 1 x 2 dientesWorld Precision Instruments501216Pinzas
dentadasCinta médica Transpore, 1527-1, 1 pulgada x 10 yardas (2,5 cm x 9,1 m)3M7000002795Cinta médica
Tubería, transparente, 3/8 pulgada de diámetro interior.Grainger CanadaUSSZUSA-HT3314 Tubo depolietileno de 1.0 cm de diámetro interno
Whatman 6720-5002 Filtros en línea de 50 mm, PTFE, 0.2 y micro; mCole-Parmer Canada Company6720-5002En línea 0.2µ Filtro M
de Dr Kent

Referencias

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  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
  2. Gaertner, M., et al.

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Etiquetas

Microscop a intravitalAdhesi n de leucocitosRodamiento de leucocitosPerfusi n capilarInflamaci n pulmonarIm genes del pulm n de rat n

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