Summary

Fabrication d’une puce à micro-motifs avec épaisseur contrôlée pour la microscopie électronique cryogénique à haut débit

Published: April 21, 2022
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Summary

Une puce à micro-motifs nouvellement développée avec des fenêtres en oxyde de graphène est fabriquée en appliquant des techniques de système microélectromécanique, permettant une imagerie efficace et à haut débit par microscopie électronique cryogénique de diverses biomolécules et nanomatériaux.

Abstract

Une limitation majeure pour l’analyse efficace et à haut débit de la structure des biomolécules à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est la difficulté de préparer des échantillons cryo-EM avec une épaisseur de glace contrôlée à l’échelle nanométrique. La puce à base de silicium (Si), qui a un réseau régulier de micro-trous avec une fenêtre d’oxyde de graphène (GO) modelée sur un film de nitrure de silicium (SixNy) à épaisseur contrôlée, a été développée en appliquant des techniques de système microélectromécanique (MEMS). La photolithographie UV, le dépôt chimique en phase vapeur, la gravure humide et sèche du film mince et la coulée par goutte de matériaux nanofeuilles 2D ont été utilisés pour la production en série des puces à micro-motifs avec des fenêtres GO. La profondeur des micro-trous est régulée pour contrôler l’épaisseur de la glace à la demande, en fonction de la taille de l’échantillon pour l’analyse cryo-EM. L’affinité favorable de GO pour les biomolécules concentre les biomolécules d’intérêt dans le micro-trou lors de la préparation de l’échantillon cryo-EM. La puce à micro-motifs avec fenêtres GO permet une imagerie cryo-EM à haut débit de diverses molécules biologiques, ainsi que de nanomatériaux inorganiques.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) a été développée pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) des protéines dans leur état natif 1,2,3,4. La technique consiste à fixer des protéines dans une fine couche (10-100 nm) de glace vitrée et à acquérir des images de projection de protéines orientées aléatoirement à l’aide d’un microscope électronique à transmission (TEM), l’échantillon étant maintenu à la température de l’azote liquide. Des milliers à des millions d’images de projection sont acquises et utilisées pour reconstruire une structure 3D de la protéine par des algorithmes de calcul 5,6. Pour une analyse réussie avec cryo-EM, la préparation des cryo-échantillons a été automatisée en gelant l’équipement qui contrôle les conditions de buvardage, l’humidité et la température. La solution d’échantillon est chargée sur une grille TEM avec une membrane de carbone trouée, successivement effacée pour éliminer l’excès de solution, puis congelée avec de l’éthane liquide pour produire de la glace mince et vitreuse 1,5,6. Avec les progrès de la cryo-EM et l’automatisation de la préparation des échantillons7, la cryo-EM a été de plus en plus utilisée pour résoudre la structure des protéines, y compris les protéines d’enveloppe pour les virus et les protéines des canaux ioniques dans la membrane cellulaire 8,9,10. La structure des protéines d’enveloppe des particules virales pathogènes est importante pour comprendre la pathologie de l’infection virale, ainsi que pour développer le système de diagnostic et les vaccins, par exemple le SRAS-CoV-211, qui a causé la pandémie de COVID-19. De plus, les techniques cryo-EM ont récemment été appliquées aux sciences des matériaux, telles que l’imagerie de matériaux sensibles aux faisceaux utilisés dans les batteries 12,13,14 et les systèmes catalytiques 14,15 et l’analyse de la structure des matériaux inorganiques à l’état de solution16.

Malgré les développements notables de la cryo-EM et des techniques pertinentes, il existe des limites dans la préparation des cryo-échantillons, ce qui entrave l’analyse de la structure 3D à haut débit. La préparation d’un film de glace vitreux avec une épaisseur optimale est particulièrement importante pour obtenir la structure 3D de matériaux biologiques à résolution atomique. La glace doit être suffisamment mince pour minimiser le bruit de fond des électrons dispersés par la glace et pour interdire les chevauchements de biomolécules le long du trajet du faisceau d’électrons 1,17. Cependant, si la glace est trop mince, elle peut entraîner l’alignement des molécules de protéines dans les orientations préférées ou dénaturer 18,19,20. Par conséquent, l’épaisseur de la glace vitreuse doit être optimisée en fonction de la taille du matériau d’intérêt. De plus, des efforts considérables sont généralement nécessaires pour la préparation des échantillons et le criblage manuel de l’intégrité de la glace et des protéines sur les grilles TEM préparées. Ce processus prend énormément de temps, ce qui nuit à son efficacité pour l’analyse de structure 3D à haut débit. Par conséquent, l’amélioration de la fiabilité et de la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM améliorerait l’utilisation de la cryo-EM en biologie structurale et en découverte commerciale de médicaments, ainsi que pour la science des matériaux.

Ici, nous présentons des procédés de microfabrication pour la fabrication d’une puce à micro-motifs avec des fenêtres en oxyde de graphène (GO) conçues pour le cryo-EM à haut débit avec une épaisseur de glace contrôlée21. La puce à micro-motifs a été fabriquée à l’aide de techniques de système microélectromécanique (MEMS), qui peuvent manipuler la structure et les dimensions de la puce en fonction des objectifs d’imagerie. La puce à micro-motifs avec fenêtres GO a une structure de micropuit qui peut être remplie avec la solution d’échantillon, et la profondeur du micropuit peut être régulée pour contrôler l’épaisseur de la glace vitrée. La forte affinité de GO pour les biomolécules augmente la concentration de biomolécules pour la visualisation, améliorant ainsi l’efficacité de l’analyse de structure. En outre, la puce à micro-motifs est composée d’un cadre En Si, qui offre une grande stabilité mécanique à la grille19, ce qui la rend idéale pour la manipulation de la puce lors des procédures de préparation des échantillons et de l’imagerie cryo-EM. Par conséquent, une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO fabriquées par des techniques MEMS assure la fiabilité et la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM, ce qui peut permettre une analyse de structure efficace et à haut débit basée sur cryo-EM.

Protocol

1. Fabrication d’une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO (Figure 1) Déposez le nitrure de silicium.Déposer du nitrure de silicium à faible contrainte (SixNy) des deux côtés de la plaquette de Si (4 pouces de diamètre et 100 μm d’épaisseur) en utilisant un dépôt chimique en phase vapeur à basse pression (LPCVD) à 830 °C et une pression de 150 mTorr, sous un débit de 170 sccm de dichlorosilane (S…

Representative Results

Une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO a été fabriquée par fabrication MEMS et transfert de nanofeuilles GO 2D. Les puces pour le micro-modelage ont été produites en série, avec environ 500 puces produites à partir d’une plaquette de 4 (Figure 1B et Figure 2A,B). Les conceptions des puces à micro-motifs peuvent être manipulées à l’aide de différents modèles du masque au chrome (Figure 2) au …

Discussion

Les procédés de microfabrication pour la production de puces à micro-motifs avec des fenêtres GO sont présentés ici. La puce fabriquée à micro-motifs est conçue pour réguler l’épaisseur de la couche de glace vitrée en contrôlant la profondeur du micro-trou avec des fenêtres GO en fonction de la taille du matériau à analyser. Une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO a été fabriquée à l’aide d’une série de techniques MEMS et d’une méthode de transfert de nanofeuilles 2D (<strong class="x…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.-H.K., S.K., M.L. et J.P. reconnaissent le soutien financier de l’Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. et J.P. reconnaissent le soutien financier du Creative-Pioneering Researchers Program par l’intermédiaire de l’Université nationale de Séoul (2021) et la subvention NRF financée par le gouvernement coréen (MSIT; N° de concession NRF-2020R1A2C2101871 et NRF-2021M3A9I4022936). M.L. et J.P. reconnaissent le soutien financier de la bourse scientifique POSCO de la FONDATION POSCO TJ Park et la subvention NRF financée par le gouvernement coréen (MSIT; N° de subvention NRF-2017R1A5A1015365). J.P. reconnaît le soutien financier de la subvention NRF financée par le gouvernement coréen (MSIT; N° de subvention NRF-2020R1A6C101A183), et les programmes d’initiatives de recherche interdisciplinaires du Collège d’ingénierie et du Collège de médecine, Université nationale de Séoul (2021). M.-H.K. reconnaît le soutien financier de la subvention NRF financée par le gouvernement coréen (MSIT; N° de subvention NRF-2020R1I1A1A0107416612). Les auteurs remercient le personnel et l’équipage du Centre d’imagerie macromoléculaire et cellulaire de l’Université nationale de Séoul (SNU CMCI) pour leurs efforts inlassables et leur persévérance dans les expériences cryo-EM. Les auteurs remercient S. J. Kim du National Center for Inter-university Research Facilities pour son aide dans les expériences FIB-SEM.

Materials

1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

Referencias

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

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Citar este artículo
Kang, M., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

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