En las sinapsis excitatorias en el cerebro de los mamíferos, el glutamato liberado presinápticamente activa los receptores incrustados en la membrana postsináptica 1,2. La fuerza de estas conexiones sinápticas sufre plasticidad dependiente de la experiencia, una propiedad que permite diversas formas de aprendizaje y memoria 3,4,5,6,7,8,9. Los cambios patológicos en el número de sinapsis y sus propiedades de señalización conducen a la actividad alterada del circuito y al procesamiento de la información que se muestra en numerosos trastornos neurológicos y psiquiátricos 10,11,12. Como tal, existe una necesidad crítica de comprender los mecanismos subyacentes que gobiernan la conectividad neuronal y la fuerza de las conexiones sinápticas.
Las sinapsis excitadoras se forman en las espinas dendríticas, pequeñas protuberancias postsinápticas que contienen proteínas de andamio, receptores, factores de señalización, proteínas citoesqueléticas y orgánulos de tráfico 1,2,13,14,15,16. Estos compartimentos de señalización de tamaño micrométrico permiten el control de la fuerza sináptica en una base de sinapsis por sinapsis13,16. La morfología de la columna dendrítica varía a lo largo de las dendritas neuronales, con formas de columna típicamente descritas como delgadas, filopodiales, rechonchas, en forma de hongo o ramificadas13. Es importante destacar que la forma de la columna vertebral se correlaciona con la función sináptica y la estabilidad. Por ejemplo, las espinas más grandes tienen un mayor número de receptores y una mayor fuerza sináptica 16,17,18. A diferencia de las espinas delgadas, las espinas más grandes pueden persistir durante meses in vivo, una propiedad que puede permitir conexiones sinápticas estables y almacenamiento de memoria a largo plazo19,20.
La morfología y la densidad de la columna vertebral a lo largo de una dendrita se rastrean comúnmente para probar el grado de conectividad neuronal y las propiedades de las sinapsis excitadoras dentro de una región particular del cerebro, tanto en estados normales como en estados de enfermedad13. Se han desarrollado una variedad de métodos para visualizar la morfología de la columna vertebral en diferentes preparaciones de tejidos y sistemas modelo utilizando microscopía estándar de luz y fluorescencia, así como superresolución y microscopía electrónica (EM)21. Estas poderosas técnicas de imagen han proporcionado una gran comprensión de nuestra comprensión actual de la organización, función y enfermedad del cerebro. Esta colección de métodos incluye importantes técnicas de imagen para monitorear la complejidad morfológica de las dendritas y las espinas, así como herramientas optogenéticas para activar y medir la actividad neuronal en dendritas y espinas individuales.
Pekarek et al.22 presentan un protocolo relativamente rápido y de alto rendimiento para obtener imágenes y cuantificar la estructura de las dendritas neuronales en lo profundo del tejido nervioso intacto. Los autores realizanC lear Lipid-exchange Acrilamida hibridada Imaging/inmunotinción/hibridación in situ compatible con Tissue-hYdrogel (CLARITY), una técnica de limpieza de tejidos que elimina los lípidos del tejido cerebral y ayuda a minimizar la dispersión de la luz durante las imágenes posteriores23 . Después de la limpieza, se recolectaron pilas Z de neuronas que expresan proteínas fluorescentes mediante microscopía confocal o de dos fotones. El análisis de imágenes y la cuantificación automatizada permitieron mediciones precisas de la densidad y la forma de la columna vertebral, así como de la complejidad de los árboles dendríticos. Este protocolo permite obtener imágenes simultáneas de estructuras que van desde espinas individuales hasta árboles dendríticos y elimina el paso lento y potencialmente dañino del corte de sección delgada. Esta técnica será muy útil para los investigadores que buscan cuantificar los cambios en la morfología de la columna vertebral y la complejidad dendrítica en tejidos cerebrales intactos después de la introducción o eliminación de un gen de interés.
Desarrollada hace más de 100 años24, la tinción de Golgi sigue siendo una herramienta poderosa para visualizar la organización del sistema nervioso y la morfología neuronal. En este método, las poblaciones dispersas de neuronas se tiñen mediante microcristalización de cromato de plata, lo que permite la visualización de axones, árboles dendríticos y espinas25. Frankfurt y Bowman26 detallan un protocolo de impregnación rápida de Golgi para visualizar neuronas y espinas dendríticas en el hipocampo de rata y la corteza prefrontal medial. Los autores demuestran cómo preparar, teñir y obtener imágenes del tejido para la microscopía óptica posterior, así como cuantificar la densidad de la columna vertebral a lo largo de los árboles dendríticos. El protocolo descrito aquí produce una impregnación consistente y confiable de las neuronas y reduce la exposición a productos químicos tóxicos.
Si bien la microscopía de luz y fluorescencia es muy adecuada para obtener imágenes de dendritas y espinas, EM permite la visualización con resolución nanométrica de estructuras pre y postsinápticas21. Los enfoques EM se utilizan típicamente para medir las propiedades ultraestructurales de las sinapsis, incluidas las dimensiones de la densidad postsináptica, así como el número y el tamaño de las vesículas sinápticas21. En esta colección, Śliwińska et al.27 proporcionan un protocolo para adquirir imágenes EM tridimensionales (3D) mediante icroscopia Electron Mde escaneo de cara debloqueo Bserial (SBEM) en tejido de ratón hipocampal28,29. Específicamente, describen cómo preparar muestras, incrustar tejido en resina, montar y recortar muestras, realizar SBEM y analizar imágenes para generar reconstrucciones 3D. Este protocolo genera imágenes de alto contraste con membranas bien definidas y se puede adaptar a una variedad de tipos de tejidos.
Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas experimentan cambios morfológicos dramáticos a medida que se forman y refinan las conexiones sinápticas por la actividad neuronal30,31. Para rastrear la maduración neuronal en el cerebelo en desarrollo, Chan et al.32 proporcionan un protocolo para la electroporación postnatal in vivo de neuronas granulares en desarrollo. Aquí, los investigadores inyectaron y electroporaron ADN en el cerebro posterior de crías de ratón postnatales para transfectar una población dispersa de neuronas con proteínas fluorescentes. La microscopía confocal de alta resolución y las imágenes 3D permitieron a los investigadores caracterizar la morfología de las dendritas y las garras dendríticas en varias etapas del desarrollo postnatal. Es importante destacar que este enfoque podría permitir la inserción o eliminación de genes que pueden afectar la maduración y función de las células granulares y será de gran interés para los investigadores que estudian el desarrollo cerebeloso y la maduración de las neuronas granulares.
Finalmente, los protocolos de Cuentas-Condori y Miller33 emplean imágenes de superresolución34, optogenética35 e imágenes de células vivas de la dinámica del calcio36 para estudiar la actividad de las neuronas GABAérgicas en el nematodo C. elegans. Usando un microscopio confocal equipado para imágenes de súper resolución37, los autores expresan proteínas fluorescentes en dendritas para medir la frecuencia de diferentes formas de columna. Además, los autores evalúan la función neuronal mediante la expresión de una proteína optogenética presinápticamente y un indicador de calcio postsinápticamente. Después de la activación de la luz de los terminales, se observaron transitorios de calcio dentro de las espinas dendríticas individuales. Estos protocolos, junto con hallazgos recientes38, destacan el emocionante uso de C. elegans como un poderoso sistema modelo para rastrear la morfología de la columna vertebral y la actividad sináptica.
En conjunto, los protocolos descritos en esta colección de métodos se sumarán a la ya rica caja de herramientas disponible para visualizar la estructura y función neuronal21. La implementación de estos métodos en estudios futuros probablemente proporcionará información adicional sobre los procesos que impulsan la plasticidad sináptica relacionada con el aprendizaje y los mecanismos celulares que subyacen a los estados de enfermedad.