Artículo de método

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

DOI:

10.3791/63759

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14 de abril de 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

En este artículo

Resumen

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Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Resumen

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Muchas enfermedades neuromusculares, como la miastenia gravis (MG), están asociadas con la disfunción de la unión neuromuscular (NMJ), que es difícil de caracterizar en modelos animales debido a las diferencias fisiológicas entre animales y humanos. La ingeniería de tejidos ofrece oportunidades para proporcionar modelos in vitro de NMJ humanos funcionales que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Al incorporar proteínas optogenéticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), generamos neuronas que pueden ser estimuladas con longitudes de onda específicas de luz. Si el NMJ es saludable y funcional, una señal neuroquímica de la motoneurona resulta en la contracción muscular. A través de la integración de la optogenética y la microfabricación con la ingeniería de tejidos, establecimos una metodología imparcial y automatizada para caracterizar la función NMJ utilizando el análisis de video. Se desarrolló un protocolo estandarizado para la formación de NMJ, la estimulación óptica con grabación de video simultánea y el análisis de video de la contractilidad del tejido. La estimulación de motoneuronas optogenéticas por la luz para inducir contracciones del músculo esquelético recapitula la fisiología humana de NMJ y permite mediciones funcionales repetidas de NMJ a lo largo del tiempo y en respuesta a diversas entradas. Demostramos la capacidad de esta plataforma para mostrar mejoras funcionales en la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y caracterizar los efectos dañinos de los anticuerpos MG o neurotoxinas del paciente en la función NMJ.

Introducción

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La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis química entre las motoneuronas (MN) y las células del músculo esquelético (SkM) que permite la contracción muscular. Las toxinas, como la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), o las enfermedades neuromusculares (NMD) como la miastenia gravis (MG) pueden conducir a la degeneración de la NMJ y reducciones en el control muscular1. Los modelos de tejidos humanos de bioingeniería recapitulan mejor los mecanismos funcionales y fisiológicos de los NMJ humanos y ofrecen un mayor potencial de traducción que los modelos animales.

Si bien los modelos animales han av....

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Protocolo

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Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU.

1. Preparación del biorreactor

  1. Hacer moldes de biorreactores
    1. Descargue un archivo CAD de biorreactor desde el archivo CAD complementario o cree un diseño propio personalizado.
    2. Genere una trayectoria de herramienta CNC a partir del modelo 3D utilizando el software CAM.
    3. Máquina de moldes de acetal utilizando una fresadora CNC.
  2. Fabricación de biorreactores
    1. Mezclar una base 10:1 co....

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Resultados

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Las uniones neuromusculares se generaron mediante el co-cultivo de motoneuronas derivadas de hiPSC optogenéticas con tejido muscular esquelético no optogenético. Los mioblastos esqueléticos primarios humanos (SkM) se sembraron en las plataformas y se diferenciaron en miotubos multinucleados utilizando el protocolo de 2 semanas. Las motoneuronas optogenéticas se diferenciaron por separado, pero en paralelo con la diferenciación de miotubos, y luego se sembraron en la plataforma (Figura 1). Lo.......

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Discusión

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Este sistema es un modelo de tejido humano 3D diseñado que combina optogenética y procesamiento de video para permitir una evaluación automatizada e imparcial de la función NMJ. Utilizando un protocolo estandarizado, hemos demostrado la capacidad de medir los cambios en la función de NMJ durante el desarrollo fisiológico y caracterizar los efectos dañinos de patologías como la exposición a neurotoxinas y los sueros de pacientes con miastenia gravis.

Estudios previos han reportado la capacidad .......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos el apoyo financiero de los NIH [números de subvención EB025765 y EB027062], el DOD [número de premio W81XWH-18-1-0095] y la UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos al Núcleo de Células Madre de la Universidad de Columbia por su ayuda y orientación con la reprogramación celular.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Solución de albúmina de suero bovinoMillipore SigmaA9576-50ML
Suplemento G-5 (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Antibiótico selectivo de genética (sulfato G418) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulina humana recombinanteMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning 354277
mTeSR PlusTecnologías de células madre100-0276
Kit de medios de crecimiento MyoTonicCook MyositeMK-4444
N-2 SuplementoThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Medio NeurobasalThermoFisher Scientific21103-049
Medio Neurobasal-A ThermoFisherScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm sistema de cubos de jaulaThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 y ER2-P4
37 µ m Filtro reversible, grandeStem Cell Technologies27250
Filtro de excitación de paso corto de 546 nmSemrockFF01-546/SP-25
Espejo dicroico de 573 nmSemrockFF573-Di01– 25x36
594 nm filtro de emisión de paso largoSemrockBLP01-594R-25
Filtro de excitación de paso largo de 594 nmSemrockBLP01-594R-25
Azul (470nm) Rebel LED en un SinkPAD-II 10mm Base Cuadrada - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Óptica de haz circular esmerilada de 10 mm - Patas integradasLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Plato de cultivo de fijación ultra bajaCorning3261
Disipador de calorLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µ m, paquete de 25, estérilPluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µ m, paquete de 25, estérilPluriSelect43-50500-03
LED Rebelde rojo (627nm) en un SinkPAD-II 10mm Base cuadrada - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
diafragma de iris accionado por anilloThorLabsSM1D12D
T-Cube Controladores LEDThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Separadores hexagonales roscados hembra,  3 1/2" 10-32, parcialmente roscado 1/2"McMaster91920A046
de perfil bajo  C-ClampMcMaster1705A12
Factores de crecimiento
Adenosina 3′,5′-monofosfato cíclicoMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR& D Systems2634/10
CNTF humano, grado de investigación, 5 y micro; gMiltenyl Biotec130-096-336
Proteína Vitronectina Humana, CFR& D Systems2349-VN-100
Proteína de vitronectina humana, CFR& D Systems2349-VN-100
IGF1 Proteína humana recombinanteThermoFisher ScientificPHG0078
Proteína de ratón laminina, naturalThermoFisher Scientific 23017015
Proteína de agrina humana recombinanteR& D Systems6624-AG-050
Proteína GDNF humana recombinante, CF 50ugR& D Systems212-GD-050/CF
Neurotrofina Humana Recombinante 3  100 ugCell SciencesCRN500D
Neurotrofina-4 Humana RecombinanteCiencias CelularesCRN501B
Erizo Sónico Humano Recombinante/Shh (C24II) N-TerminusR& D Systems1845-SH-100
Recombinante Humano/Murino/Rata BDNF 50 ugPeprotech450-02
Ácido Retinoico, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Agonista SuavizadoMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectina de plasma humanoMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 diclorhidratoTocris1254
Anticuerpos
alfa;-actinina mAb (IgG1 de ratón)Abcamab9465
Colina acetiltransferasa (ChAT) (cabra)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Ratón IgG1)DakoM076029-2
Cadena pesada de miosina (MHC) (Ratón IgG2b)DSHBMF20
Equipo
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Escenario automatizadoInstrumentación científica aplicadaMS- 2000 XYZ
Limpiador de plasma expandidoHarrick PlasmaPDC-001 ( 115V)
Invitrogen Countess Contador de células automatizadoMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Microscopio de fluorescencia invertidaSerieIX-ILL100LH
Olympus Sistema de incubadora superior de etapaTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Cámara Zyla 4.2 sCOMS TecnologíaAndorZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
Mastercam MastercamMastercam para Solidworks
MatlabMatlabR2021b
Elementos NISNikonBasic Research
Solidworks 3DCAD Solidworks SolidworksStandard
&

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G.

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Etiquetas

Optogenetic Neuromuscular JunctionHuman NMJ ModelTissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsOptogenetic StimulationMuscle Contraction AnalysisMicrofabrication TechniquesVideo Contractility AnalysisMyasthenia Gravis ModelMotor Neuron Differentiation

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