Artículo de método
La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.
La membrana basal (BM), una lámina especializada de matriz extracelular presente en el lado basal de las células epiteliales, es crítica para el establecimiento y mantenimiento de la morfología del tejido epitelial y la morfogénesis de los órganos. Además, el BM es esencial para el modelado de tejidos, sirviendo como una plataforma de señalización y proporcionando fuerzas externas para dar forma a los tejidos y órganos. A pesar de los muchos papeles importantes que desempeña el BM durante el desarrollo normal y las condiciones patológicas, las vías biológicas que controlan el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y cómo la secreción basal conduce a la deposición polarizada de las proteínas BM son poco conocidas. El epitelio folicular del ovario de Drosophila es un excelente sistema modelo para estudiar la deposición basal de proteínas de membrana BM, ya que produce y secreta todos los componentes principales del BM. Las imágenes confocales y de superresolución combinadas con el procesamiento de imágenes en tejidos fijos permiten la identificación y caracterización de factores celulares específicamente involucrados en el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM. Este artículo presenta un protocolo detallado para teñir y obtener imágenes de vesículas que contienen BM y BM depositadas utilizando proteínas marcadas endógenamente en el epitelio folicular del ovario de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar para abordar cuestiones cualitativas y cuantitativas y fue desarrollado para acomodar el cribado de alto rendimiento, lo que permite la identificación rápida y eficiente de los factores involucrados en el tráfico intracelular polarizado y la secreción de vesículas durante el desarrollo del tejido epitelial.
La membrana basal (BM) es una lámina delgada de matriz extracelular adherente a células en capas (ECM) crítica para la estructura epitelial y la morfogénesis1. Comprende ~ 50 proteínas y se encuentra ubicuamente subyacente a las células epiteliales y endoteliales, y entuba las células esqueléticas, lisas y del músculo cardíaco y los adipocitos 1,2,3. Los tres componentes principales de la BM en el lado basal de las células epiteliales son el colágeno IV, el perlecano y las lamininas. El BM subyace a las células epiteliales y es responsable de muchas fu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
1. Preparación de moscas para disecciones de ovarios
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para obtener imágenes y caracterizar de manera eficiente y precisa el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en células epiteliales polarizadas, como la FE del ovario de Drosophila . A continuación, proporcionamos resultados anticipados obtenidos utilizando los métodos descritos, así como consejos útiles y posibles dificultades. Para ello, se utiliza Vkg-GFP, un Vkg etiquetado endógenamente (Drosophila Col IV). Sin embargo, los mism.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
El BM es crítico para la morfogénesis embrionaria y de órganos, y las funciones fisiológicas adultas. Además, el BM actúa como plataforma de señalización para el establecimiento y mantenimiento de la polaridad epitelial y proporciona soporte a los tejidos2. Sin embargo, los mecanismos que regulan la colocación adecuada de las proteínas BM son poco conocidos. Una mejor comprensión de las vías biológicas dedicadas al tráfico intracelular y la secreción polarizada de las proteínas BM requiere un anál.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen a Julie Merkle por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la subvención R15GM137236 de los NIH a O.D. Las imágenes confocales y de superresolución se adquirieron utilizando un Zeiss LSM 900 con Airyscan 2, comprado con la subvención NSF MRI 2018748.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 faloidina | Invitrogen | A22283 | Tinción de actina F (1/500 de 66µ M) |
| Alexa Fluor 647 faloidina | Invitrogen | A22287 | Tinción de F-actina (1/100 de 66µ M)) |
| Anticuerpo anti-GM130 | abcam | ab30637 | para la tinción de Golgi (colocalización); uso como concentración de 7µ g/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Medio de montaje |
| Levadura de panadería (levadura seca activa) | Genesee Scientific | 62-103 | Para engordar los overies para la disección |
| Albúmina sérica bovina (solución al 30%) | Sigma-Aldrich | A7284 | Para solución de bloqueo |
| Pozos de depresión | Microscopía electrónica | 7156101 | Para la disección (en su lugar, se puede utilizar un portaobjetos de concavidad de vidrio) |
| Aguja de disección | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Incubadora de Drosophila | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Stock de moscas: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (línea TRIP HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi contra Crag |
| Stock de moscas: Línea Viking-GFP Drosophila (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Stock de moscas: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Impulse la expresión de ARNi de Crag en las | ||
| pinzas FE (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | Para la disección |
| Diapositiva de concavidad de vidrio | Ciencias de la microscopía electrónica 7187804 | Para la disección (se pueden usar pozos de depresión en su lugar) | |
| IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Anticuerpo secundario (anticuerpo GM130) (5 y micro; g/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Limpiaparabrisas de tareas delicadas |
| Microscopio estereoscópico fluorescente Leica M165 FC | Leica | Para la imagen de los ovarios | |
| Portaobjetos de microscopio | Corning | 294875X25 | Portaobjetos de microscopio |
| Balancín de plataforma nutante | Corning Life Sciences | 6720 | Para la fijación y tinción de ovarios |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehído 20% Solución | Microscopía Electrónica Sciences | Fisher Científico: 15713 | Para PFA 4% |
| Tabletas de solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | BP2944100 | para solución de PBS |
| ProLong Glass Antidecoloración Mountant | Invitrogen | P36980 | |
| de vidrio cuadrado | Corning | 285022 | Cubreobjetos para portaobjetos de microscopio |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | para PBST |
| Zeiss LSM 900 con Airyscan 2 Microscopio | Zeiss | confocal y de superresolución | |
| Microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 305 | Microscopio de disección | Zeiss | |
| Zen Software Zeiss versión 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Adquisición y procesamiento de imágenes |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE
Solicitar permiso