La microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM) permite obtener imágenes de superresolución y etiquetado de alta eficiencia

Resumen

Se demuestra un protocolo de microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM). LR-ExM utiliza un novedoso conjunto de anclajes trifuncionales, que proporciona una mejor eficiencia de etiquetado en comparación con las microscopías de expansión introducidas anteriormente.

Resumen

La microscopía de expansión (ExM) es una técnica de preparación de muestras que se puede combinar con la mayoría de los métodos de microscopía óptica para aumentar la resolución. Después de incrustar células o tejidos en hidrogel hinchable, las muestras se pueden expandir físicamente de tres a dieciséis veces (dimensión lineal) en comparación con el tamaño original. Por lo tanto, la resolución efectiva de cualquier microscopio se incrementa por el factor de expansión. Una limitación importante del ExM introducido previamente es la reducción de la fluorescencia después de la polimerización y el procedimiento de digestión. Para superar esta limitación, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que evita la pérdida de señal y mejora en gran medida la eficiencia del etiquetado utilizando un conjunto de nuevos anclajes trifuncionales. Esta técnica permite lograr una resolución más alta cuando se investigan estructuras celulares o subcelulares a escala nanométrica con una pérdida mínima de señal fluorescente. LR-ExM se puede utilizar no solo para el etiquetado de inmunofluorescencia, sino también con etiquetas de proteínas automarcantes, como las etiquetas SNAP y CLIP, logrando así una mayor eficiencia de etiquetado. Este trabajo presenta el procedimiento y la solución de problemas para este enfoque basado en la inmunotinción, así como la discusión de los enfoques de etiquetado automático de LR-ExM como alternativa.

Introducción

La microscopía de expansión (ExM) ha sido utilizada por los investigadores desde que se introdujo por primera vez como un enfoque conveniente para lograr imágenes de súper resolución con microscopios convencionales, como los microscopios de epifluorescencia y confocales 1,2,3,4,5,6,7 . Usando ExM, es posible lograr una resolución lateral de ~70 nm incluso con microscopios confocales regulares. Cuando ExM se combina con imágenes de súper ....

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Utilice células U2OS cultivadas en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de FBS a 37 °C en 5% de_CO2.
2. Cultive las células en un vidrio de cubierta con cámara extraíble de 16 pozos (área de cultivo de 0,4 cm²) para facilitar su manejo.

2. Fijación y permeabilización

NOTA: Las condiciones de fijación y permeabilización dependen de los protocolos optimizados de inmunotinción. El siguiente es un protocolo de fijación y permeabilización para la co-inmunotinción de microtúbulos y fosas recubiertas de clatrina (CCP).

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Resultados

Los hoyos recubiertos de clotrina (CCP) se inmunotiñen utilizando anclajes trifuncionales (Figura 1B) y LR-ExM se realiza como se describe en la Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) muestra una intensidad de fluorescencia mucho mayor en comparación con la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM, Figura 2A) o la biotina-ExM (Figura 2B); la seña.......

Discusión

La innovación clave de LR-ExM es utilizar anclajes trifuncionales para etiquetar eficazmente las proteínas diana y mejorar la calidad de imagen. Este método está limitado por anclajes trifuncionales, que no están tan fácilmente disponibles para los investigadores. Sin embargo, los anclajes trifuncionales se pueden compartir con otros investigadores a pedido, y productos similares como las sondas ExM de Chrometa ahora también están disponibles comercialmente.

En este protocolo, se ha realizado .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acrilamida	Sigma	A9099	Gel ExM
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711– 005-152	Anticuerpo
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H + L, 712 – 005-153	Anticuerpo
Alexa Fluor 488-Estreptavidina	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Sondas fluorescentes
Alexa Fluor 594 Estreptavidina	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Sondas fluorescentes
Alexa Fluor 647 Estreptavidina	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Sondas fluorescentes
Persulfato de amonio	Sigma	A3678	Gel ExM
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Anticuerpo
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Anticuerpo
DAPI dilacetato	Thermofisher Scientific	D3571	Sondas fluorescentes
DyLight 488 Etiquetado con Anti-Digoxigenina/Digoxina (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Sondas fluorescentes
DyLight 594 Etiquetado con anti-digoxigenina/digoxina (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Sondas fluorescentes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Tampón de fijación
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma	Tampón de digestión	EDTA
Glutaraldehído 10% Grado EM	Microscopía electrónica Ciencias	50-262-13	Anclaje
Grace Bio-Labs CultureCubreobjetos con cámara extraíble	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA Cámara de	cultivo celular
Grace Bio-Labs Herramienta de eliminación CultureWell	Grace Bio-Labs	GBL103259	Herramienta de eliminación
Guanidina HCl	Sigma	G3272	Tampón de digestión
Cloruro de magnesio	Sigma	M8266-1KG	Tampón
de fijación McCoy's 5a	ATCC	30– 2007	Medio de cultivo de celll
Ácido metacrílico N-hidroxisuccinimida éster, 98%   (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anclaje
monoclonal ratón anticuerpo anti-Nup153	Abcam	ab24700	Anticuerpo
N,N′ Methylenebisacrilamida	Sigma	M7279	Gel ExM
N,N,N&primo;,N&primo; Tetrametiletilendiamina  (TEMED)	Sigma	T7024	Gel ExM
16% Paraformaldehído Soluciones acuosas	Microscopía Electrónica Ciencias	50-980-487	Tampón
de fijación PIPES	Sigma	P6757-25G	Tampón de fijación
Poly-L-Lisina	Sigma	P8920-100ML Recubrimiento de	cámara
Proteinasa K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Tampón de digestión
Anticuerpo de cadena pesada anticlatrina de conejo	Abcam	ab21679	Anticuerpo
anti&ndash para ratas; &alfa;-anticuerpo de tubulina, tirosinado, clon YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Anticuerpo
de Acrilato de Sodio	Sigma	408220	ExM Gel
Estreptavidina / Kit de bloqueo de biotina	Vector Laboratories	SP-2002	Tampón de bloqueo
Tris-HCl	Tecnologías de la Vida	AM9855	Tampón de digestión
U2OS	ATCC	HTB-96	Línea celular
Placas inferiores de vidrio de 6 pocillos	Cellvis	P06-1.5H-N	Placa de imagen