La microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM) permite obtener imágenes de superresolución y etiquetado de alta eficiencia

La microscopía de expansión (ExM) ha sido utilizada por los investigadores desde que se introdujo por primera vez como un enfoque conveniente para lograr imágenes de súper resolución con microscopios convencionales, como los microscopios de epifluorescencia y confocales 1,2,3,4,5,6,7 . Usando ExM, es posible lograr una resolución lateral de ~70 nm incluso con microscopios confocales regulares. Cuando ExM se combina con imágenes de súper resolución, la resolución se mejora aún más. Por ejemplo, se puede lograr una resolución de aproximadamente 30 nm con microscopía de iluminación estructurada (SIM), y una resolución de aproximadamente 4 nm con microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)^1,5.

Sin embargo, la baja eficiencia de etiquetado es un problema crítico con los métodos ExM estándar. La pérdida de fluorescencia puede variar según el tipo de grupos fluorescentes y el tiempo de digestión. En promedio, sin embargo, se ha relatado que más del 50% de los fluoróforos se pierden después de la polimerización y los pasos de digestión de proteínas de ExM, lo que es perjudicial para la calidad de la imagen ^3,4.

Por lo tanto, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que puede retener etiquetas de manera eficiente y reducir la pérdida de señal¹. La innovación clave de LR-ExM es el uso de un conjunto de anclajes trifuncionales en lugar de simplemente usar colorantes fluorescentes, como en el procedimiento estándar ExM, para teñir proteínas de interés. Estos enlazadores trifuncionales constan de tres partes: (1) el conector (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)) para conectarse al anticuerpo, (2) el anclaje (por ejemplo, metacrilamida (MA)) para anclar proteínas al polímero, y (3) el informador (por ejemplo, biotina o digoxigenina (DIG)) para conjugar a un colorante orgánico. Los anclajes trifuncionales sobreviven a los pasos de polimerización y digestión de proteínas y, por lo tanto, evitan la pérdida de fluoróforos.

Además, este método tiene un gran potencial ya que es compatible con etiquetas enzimáticas autoetiquetadas como SNAP o CLIP. Los enfoques de etiquetas enzimáticas tienen algunos beneficios sobre el enfoque de inmunotinción con respecto a la alta especificidad y la eficiencia de etiquetado ^8,9,10.

En este manuscrito, se demuestra un procedimiento detallado de LR-ExM. LR-ExM es un método altamente efectivo y flexible para lograr una alta resolución espacial con una mayor eficiencia de etiquetado.

1. Cultivo celular

1. Utilice células U2OS cultivadas en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de FBS a 37 °C en 5% de_CO2.
2. Cultive las células en un vidrio de cubierta con cámara extraíble de 16 pozos (área de cultivo de 0,4 cm²) para facilitar su manejo.

2. Fijación y permeabilización

NOTA: Las condiciones de fijación y permeabilización dependen de los protocolos optimizados de inmunotinción. El siguiente es un protocolo de fijación y permeabilización para la co-inmunotinción de microtúbulos y fosas recubiertas de clatrina (CCP).

1. Una vez que los recuentos celulares alcancen ~0.04 x 10 6, fije las células con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 3.2% en tampón PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA y 1 mM MgCl₂, pH^6.9) durante 10 min a temperatura ambiente (Tabla 1).
   NOTA: La fijación con PFA se realiza en una campana de seguridad certificada.
2. Lave las células tres veces durante 5 minutos cada una con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Permeabilizar las células con los 100 μL de tampón de permeabilización a temperatura ambiente durante 15 min (Tabla 1).
   NOTA: Proceda con el etiquetado lo antes posible para evitar la degradación de la proteína diana, el ARN o el ADN, y para obtener un resultado óptimo. Sin embargo, si es necesario, las muestras fijas pueden almacenarse durante un tiempo prolongado (hasta un mes) en un tampón PBS a 4 °C. Reemplace cualquier PBS evaporado y proteja la muestra del fotoblanqueo.

3. Bloqueo endógeno de estreptavidina y biotina

1. Incubar las células con la solución de estreptavidina diluida en un tampón de bloqueo celular (100 μL) durante 15 min a temperatura ambiente (Tabla 1).
2. Enjuague brevemente con 200 μL de tampón de bloqueo celular.
3. Incubar las células con 100 μL de solución de biotina diluida en un tampón de bloqueo celular durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Cuando utilice un enfoque de etiquetado automático, como el uso de etiquetas SNAP o CLIP-, omita el paso 4 y continúe con el paso 5.1: Enfoque de etiquetado automático.

4. Tinción primaria de anticuerpos

1. Incubar células con anticuerpos anti-α-tubulina de rata (dilución 1:500) y anticuerpos de cadena pesada anticlatrina de conejo (dilución 1:100) en 100 μL de tampón de bloqueo celular durante 16 h a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente. Duplique el tiempo de incubación de las muestras de tejido.
2. Lave las muestras cuatro veces con 200 μL de PBS durante 5 minutos cada una.

5. Tinción de anticuerpos secundarios específicos de LR-ExM

1. Anticuerpos IgG conjugados con los enlazadores trifuncionales como N-hidroxisuccinimida (NHS) - metacrilamida (MA) -Biotina o NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). La síntesis de anclajes trifuncionales y la conjugación de los anticuerpos secundarios se introducen previamente en Shi et ^al.1. Enfoque de etiquetado automarcado: anticuerpos IgG conjugados con los enlazadores trifuncionales, como MA-bencilguanina (BG)-biotina o MA- bencilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). La síntesis de anclajes trifuncionales y una conjugación de los anticuerpos secundarios se introducen previamente en Shi et ^al.1.
2. Incubar células con los anticuerpos secundarios burro anti-conejo-Dig-MA (dilución 1:100) y burro anti-rata-biotina-MA (dilución 1:100) en 100 μL de tampón de bloqueo celular durante 1 h a temperatura ambiente. Duplique este tiempo de incubación para las muestras de tejido.
3. Lave las muestras cuatro veces en 200 μL de PBS durante 5 minutos cada una.

6. Anclaje adicional

1. Incubar células con glutaraldehído (GA) al 0,25% en PBS (100 μL) durante 15 min a temperatura ambiente para anclar las proteínas al hidrogel. Alternativamente, use éster de N-hidroxisuccinmida de ácido metacrílico de 25 mM (MA-NHS) para el anclaje. Se recomienda una incubación de una hora a temperatura ambiente.
2. Lave las muestras tres veces en PBS durante 5 minutos cada una.

7. Gelificación

NOTA: La velocidad de expansión está determinada por el tiempo de difusión de sal y agua hacia afuera o dentro del gel; Por lo tanto, la fundición de geles finos acelera el tiempo de expansión.

1. Retire la estructura superior de la placa de gel de 16 pocillos. Agregue 40 μL de solución de monómero a cada pocillo para acondicionar las células en hielo. Incubar en hielo durante 5 min.
   1. Para preparar una solución de monómero, ver Tabla 2.
2. Prepare la solución de gelificación en hielo. Agregue agua destilada doble y un acelerador de N,N,N′,N′ tetrametiletilendiamina (TEMED) al 10% a la solución de monómero (TEMED al 10%: solución de monómero = 1:47); no agregue el iniciador todavía (Tabla 3).
3. Para una cámara de cultivo celular con un área de 0,4 cm², use un volumen de solución de gelificación de aproximadamente 40 μL. Prepare 45 μL de solución de gelificación para cada pocillo.
4. Agregue persulfato de amonio (APS) al 10% a la solución de gelificación, incubar en hielo e inmediatamente pipetear 40 μL de solución de gelificación en cada junta de silicona bien sobre hielo. Incubar en hielo durante 3 min (10% APS:10% TEMED:solución monómera = 1:1:47).
5. Proteger la muestra de la luz y mover el vidrio de cubierta de la placa de Petri de 10 cm a una incubadora a 37 °C durante 1,5 h para la gelificación. Para mantener la humedad del gel durante la incubación a 37 °C, cubra la placa de Petri con la tapa y ponga unas gotas de agua en la placa de Petri.

8. Digestión

1. Después de la gelificación, retire el vaso para separar el gel y transfiera el gel a la placa de 6 pocillos. Digerir las células incrustadas con 2 ml de tampón de digestión (Tabla 1) durante la noche a temperatura ambiente o 4 h a 37 °C. Use al menos 10 veces el exceso de volumen de tampón de digestión.
2. Lave los geles con al menos un exceso de 10 veces el volumen de agua que el volumen final del gel. Repita el paso de lavado cuatro veces durante 20 a 30 minutos cada vez. El gel se expande aproximadamente dos veces en cada dimensión.
   NOTA: Las muestras de gel se pueden almacenar hasta 1 mes en un tampón PBS a 4 °C. Reemplace el agua evaporada para evitar que se seque y proteja la muestra de la luz durante el almacenamiento. Para evitar la degradación de los anclajes trifuncionales, las muestras deben teñirse lo antes posible después de la digestión y el lavado.

9. Tinción de fluorescencia post-digestión

1. Incubar geles en un volumen de 2 ml de tampón de tinción de estreptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) con colorante STV de 2 a 5 μM y/o colorante anti-DIG durante 24 h a temperatura ambiente. Mantenga las muestras en la oscuridad.

10. Expansión

1. Lave y expanda el gel cuatro veces con agua excesiva (2-3 ml) durante 30 minutos a 1 h cada vez.
2. Para facilitar la visualización de las células bajo microscopía fluorescente, tiñe las células con DAPI durante el tercero de los cinco lavados. Concentración madre diluida de DAPI (5 mg/ml, almacenada a 4 °C) en diluciones 1:5.000 en agua de lavado. Incubar el gel con una solución de agua DAPI (2 mL) durante 30 min a 1 h.
3. Lave dos veces adicionales con 3 ml de agua.
4. Expanda los geles en cualquier plato plano que sea lo suficientemente grande como para contener las muestras. Los geles expandidos que se preparan en vidrio de cubierta de^{0,4 cm 2} encajan muy bien en una placa de 6 pocillos con fondo de vidrio.
   NOTA: Las muestras teñidas después de la expansión se pueden almacenar hasta 4 meses en un tampón PBS a 4 ° C. Agregue suficiente agua para evitar que se seque y proteja la muestra del fotoblanqueo. Repita el paso de expansión y tinción DAPI antes de la imagen. Para evitar cualquier riesgo de degradación del fluoróforo, las muestras deben ser fotografiadas tan pronto como sea posible.

11. Imágenes

1. Cubra la cámara de imágenes con fondo de vidrio de 6 pocillos con poli-L-lisina al 0,01% (3 ml cada una) para inmovilizar las muestras de gel.
2. Transfiera muestras de gel a la cámara de imágenes recubierta.
3. Imagen de las muestras con cualquier osciloscopio de fluorescencia deseado.

Los hoyos recubiertos de clotrina (CCP) se inmunotiñen utilizando anclajes trifuncionales (Figura 1B) y LR-ExM se realiza como se describe en la Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) muestra una intensidad de fluorescencia mucho mayor en comparación con la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM, Figura 2A) o la biotina-ExM (Figura 2B); la señal para LR-ExM fue aproximadamente seis veces mayor que proExM (Figura 2D). LR-ExM puede capturar eficazmente estructuras pequeñas como CCP, que son incluso más pequeñas que el límite de difracción (Figura 2F, G).

Algunos resultados representativos de LR-ExM se muestran mediante el uso del enfoque de inmunotinción. Los microtúbulos y los CCP se co-inmunotiñen utilizando anclajes trifuncionales, incluyendo NHS-MA-DIG y NHS-MA-biotina (Figura 3A, B). LR-ExM está disponible para el enfoque basado en etiquetas enzimáticas. El resultado se demuestra utilizando los anclajes trifuncionales BG-MA-biotina (para SNAP-tag) y BC-MA-DIG (para CLIP-tag) en la Figura 3C-F. Además, se puede combinar tanto la inmunotinción como el enfoque de etiqueta de proteína en LR-ExM, como se muestra en la Figura 3G-J. A partir de estos resultados, se confirma que LR-ExM es beneficioso para obtener imágenes de alta calidad con una mayor eficiencia de etiquetado y resolución.

LR-ExM también muestra un gran rendimiento en muestras de tejido. LR-ExM se realiza en el tejido cerebral del ratón mediante la co-inmunotinción del marcador presináptico Basgot y el marcador postsináptico Homer1. Las dos etiquetas son transparentes y están bien separadas, lo que admite alta resolución y eficiencia de etiquetado (Figura 4A-E).

Figura 1: Flujo de trabajo de la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM). a) Flujo de trabajo de LR-ExM. (B) Esquemas de anclajes trifuncionales. Esta figura ha sido modificada de Shi et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de imágenes confocales de microscopía de expansión (ExM) de retención de señal (A-C) de fosas recubiertas de clatrina (CCP) en células U2OS indirectamente inmunoteñidas para la cadena pesada de clatrina (POI). (A) ExM de retención de proteínas (ProExM) utilizando anticuerpos secundarios conjugados con AF488. (B) ExM con etiquetado posterior a la expansión utilizando anticuerpos conjugados con biotina. (C) LR-ExM utilizando anticuerpos conjugados con anclajes trifuncionales NHS-MA-biotina. Las muestras en B y C se tiñen después de la expansión con estreptavidina-AF488. (D) Cuantificación de la intensidad de A-C. Las barras de error representan SD. n = 3 para cada caso. Las relaciones de expansión de longitud para las imágenes en A, B, C y E-G son 4.3, 4.5, 4.6 y 4.3, respectivamente. La relación de expansión de longitud para las muestras utilizadas en la parcela D es de 4,5 ± 0,2. Barras de escala, 500 nm (A-C y E) y 100 nm (F y G). Todas las barras de escala están en unidades de preexpansión. Arb. U., unidades arbitrarias; STV: estreptavidina. Todas las imágenes se obtienen utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Nikon CSU-W1) con un objetivo de inmersión en agua de 60x (NA1.27). Esta figura ha sido modificada de Shi et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos de LR-ExM usando microscopios confocales. (A,B) Imágenes confocales LR-ExM de microtúbulos marcados con anticuerpos secundarios conjugados con NHS-MA-biotina (magenta) y CCPs marcados con anticuerpos secundarios conjugados NHS-MA-DIG (verde) en una célula U2OS. (B) Vista ampliada. (C-F) Imágenes confocales LR-ExM de CCP y/o mitocondrias en células HeLa marcadas mediante el enfoque de etiqueta de proteínas (C) clatrina etiquetada con etiqueta SNAP, (D) TOMM20 etiquetada con etiqueta CLIP y (E) imágenes de dos colores. (F) Vista ampliada. (G) Imágenes LR-ExM confocales de dos colores utilizando una combinación de enfoque de inmunotinción (NPC, al rojo vivo) y enfoque de etiqueta de proteína (lamina A/C (cian) marcada con SNAP). (H) Vista ampliada. (I,J) Vistas de canales individuales de H. Tenga en cuenta que el fondo citoplasmático en G es causado por el anticuerpo anti-NUP153. Las relaciones de expansión de longitud para imágenes en A-B: 4.7, C-D: 4.4, E-F: 4.5 y G-J son 4.5. Barras de escala: 1 μm para A, 200 nm para B y F, 500 nm para C-E, 2 μm para G y 500 nm para H, I y J. Todas las barras de escala están en unidades de preexpansión. Todas las imágenes se obtienen utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Nikon CSU-W1) con un objetivo de inmersión en agua de 60x (NA1.27). Esta figura ha sido modificada de Shi et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos de LR-ExM en muestras de tejido. (A) Imagen confocal LR-ExM de corte cerebral de ratón indirectamente inmunoteñido para el marcador presináptico Basgot (magenta) y el marcador postsináptico Homer1 (verde). (B,C) Imágenes ampliadas de sinapsis. (D,E) Perfiles de intensidad transversal a lo largo de los ejes largos de la caja amarilla. Basgot está marcado con anticuerpos secundarios conjugados NHS-MA-DIG, y Homer1 está marcado con anticuerpos secundarios conjugados con NHS-MA-biotina. Todas las muestras se tiñen después de la expansión con estreptavindin-AF488 y/o anti-digoxina-AF594. Las relaciones de expansión de longitud para las imágenes en A-C son 4.2. Barras de escala, 1 μm (A) y 200 nm (B,C). Todas las barras de escala están en unidades de preexpansión. Todas las imágenes se obtienen utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Nikon CSU-W1) con un objetivo de inmersión en agua de 60x (NA1.27). Esta figura ha sido modificada de Shi et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Productos químicos y tampones Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Solución monómera Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Solución de gelificación Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.