Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.
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Artículo de método
Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante el desarrollo de los vertebrados, las células de la cresta neural (NCC) migran ampliamente y se diferencian en varios tipos de células que contribuyen a estructuras como el esqueleto craneofacial y el sistema nervioso periférico. Si bien es fundamental comprender la migración de NCC en el contexto de un embrión 3D, el aislamiento de células migratorias en cultivo 2D facilita la visualización y la caracterización funcional, complementando los estudios embrionarios. El presente protocolo demuestra un método para aislar los pliegues neurales craneales de los pollitos para generar cultivos primarios de NCC. Los NCC migratorios emergen de los explantes del pliegue neural colocados en un sustrato recubierto de fibronectina. Esto da como resultado poblaciones de NCC dispersas y adherentes que pueden evaluarse mediante tinción y análisis morfológicos cuantitativos. Este enfoque de cultivo simplificado es altamente adaptable y se puede combinar con otras técnicas. Por ejemplo, la emigración de NCC y los comportamientos migratorios pueden evaluarse mediante imágenes de lapso de tiempo o consultarse funcionalmente mediante la inclusión de inhibidores o manipulaciones experimentales de la expresión génica (por ejemplo, ADN, morfolino o electroporación CRISPR). Debido a su versatilidad, este método proporciona un poderoso sistema para investigar el desarrollo craneal de NCC.
Introducción
Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular transitoria en embriones de vertebrados. Las NCC se especifican en los bordes de la placa neural y experimentan una transición epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar desde el tubo neural dorsal1. Después de la EMT, las NCC se dispersan extensamente por todo el embrión, diferenciando y contribuyendo finalmente a varias estructuras, incluido el esqueleto craneofacial, el tracto de salida del corazón y la mayoría del sistema nervioso periférico2. Los cambios en la polaridad celular, el citoesqueleto y las propiedades de adhesión subyacen a este cambio de una p....
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Protocolo
Se puede usar cualquier variedad de razas Gallus gallus , incluyendo White Leghorn, Golden Sex Link o Rhode Island Red. Los huevos de gallina utilizados en el presente estudio eran de varias razas y se obtuvieron de múltiples fuentes, incluidas granjas y criaderos locales.
1. Preparación de soluciones y materiales
- Prepare la solución de Ringer mezclando 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl 2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM deNa2HPO 4 y 0,147 mM de KH2 PO4 (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el pH a 7.4 y filtre esterilizar en botellas de....
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Resultados
En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo actual. Los huevos incubados se abrieron y la yema, con el embrión en la superficie, se aisló vertiendo suavemente en la palma de una mano enguantada (Figura 2A, B). Después de eliminar la albúmina (Figura 2C), se aplicaron marcos de papel de filtro a la membrana vitelina que rodea el embrión para facilitar el corte y la elevación del embrión de la yema.......
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Discusión
La técnica descrita aquí proporciona un método adaptable para aislar los pliegues neurales de los pollitos y colocarlos en placas para crear cultivos de NCC craneales migratorios. Estos cultivos proporcionan condiciones 2D simplificadas para un fácil análisis de la migración y morfología de NCC de los pollitos que pueden complementar los métodos de imagen in ovo más desafiantes técnicamente24,25,26. Si bien este método .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Corinne A. Fairchild y Katie L. Vermillion, quienes participaron en el desarrollo de nuestra versión del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal del pollo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AxioObserver equipado con un cabezal de escaneo confocal LSM710 controlado por el software ZEN 3.0 SR | Zeiss | Usado alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Aceite DIC M27 objetivo | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Platos de cámara (fondo de vidrio, individuales o divididos) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) | Cubierta de 35 mm o 4 cámaras de 35 mm |
| Cubreobjetos de 35 | Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | círculos, 0.13– 0,17 mm de espesor, disponible en 12-25 mm de diámetro |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific 11320033 | Alternativa para medios L15 | |
| Incubadora de huevos | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectina | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Papel de filtro | Cromatografía de grado Whatman | ||
| 3MM Pinzas (romas) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher); 1141W97 (Thomas) | |
| Pinzas (finas) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Software gratuito de análisis de imágenes | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030 | |
| Medios de montaje (Vectashield o ProLong Gold) | Laboratorios de vectores; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Unidades/mL de Penicilina; 10,000 mg/mL Estreptomicina |
| Placas de Petri | VWR (o similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Faloidina | Sigma-Aldrich | P1951 | múltiples fluróforos disponibles |
| Soporte de alfiler | Fine Science Tools | 26016-12 | Para aguja de tungsteno (alternativa a las tijeras de resorte) |
| Tijeras (disección) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 15000-08 | Filo de corte de 2,5 mm (alternativa a la aguja de tungsteno) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Filtros de jeringa | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Unidad de filtro de jeringa, 0,22 y micro; m, PVDF, 33 mm, esterilizado con rayos gamma |
| Placas de cultivo de tejidos | Sarstedt | 83-3900 Placas de | cultivo de 35 mm para cultivos de pliegues neuronales a granel |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Alambre de tungsteno | Variedad de fuentes | 0,01" de diámetro para aguja de tungsteno (alternativa a las tijeras de resorte) |
Referencias
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
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Reimpresiones y permisos
