Las neuronas nociceptoras y las células NK interactúan activamente en un contexto inflamatorio. Un enfoque de co-cultura permite estudiar esta interacción.
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Artículo de método
Descubrir la interacción entre las células asesinas naturales y las neuronas nociceptoras
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas somatosensoriales han evolucionado para detectar estímulos nocivos y activar reflejos defensivos. Al compartir medios de comunicación, las neuronas nociceptoras también sintonizan las defensas del huésped al controlar la actividad del sistema inmunológico. La comunicación entre estos sistemas es principalmente adaptativa, ayudando a proteger la homeostasis, también puede conducir a, o promover, la aparición de enfermedades crónicas. Ambos sistemas coevolucionaron para permitir dicha interacción local, como se encuentra en los tejidos linfoides primarios y secundarios y la mucosa. Estudios recientes han demostrado que los nociceptores detectan y responden directamente a antígenos extraños, citoquinas derivadas de células inmunes y microbios.
La activación de los nociceptores no solo produce hipersensibilidad al dolor y picazón, sino que también reduce el umbral de disparo del nociceptor, lo que lleva a la liberación local de neuropéptidos. Los péptidos que son producidos por, y liberados de, los terminales periféricos de los nociceptores pueden bloquear la quimiotaxis y la polarización de los linfocitos, controlando la localización, la duración y el tipo de inflamación. La evidencia reciente muestra que las neuronas sensoriales interactúan con las células inmunes innatas a través del contacto célula-célula, por ejemplo, involucrando receptores del grupo 2D (NKG2D) en células asesinas naturales (NK).
Dado que las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores, es concebible que los nociceptores utilicen neuropéptidos para controlar la actividad de las células NK. Aquí, ideamos un método de cocultivo para estudiar las interacciones neuronal-célula NK nociceptor en un plato. Usando este enfoque, encontramos que las neuronas nociceptoras lumbares disminuyen la expresión de citoquinas de las células NK. En general, tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo las neuronas inervantes de tumores controlan la función anticancerígena de las células NK y cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas.
Introducción
Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales se originan en los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Los DRG se encuentran en el sistema nervioso periférico (SNP), entre el asta dorsal de la médula espinal y las terminales nerviosas periféricas. La naturaleza pseudo-unipolar de las neuronas DRG permite la transferencia de información de la rama periférica, que inerva el tejido diana, a la rama central, que lleva la información somatosensorial a la médula espinal1. Utilizando receptores de canales iónicos especializados, las neuronas de primer orden detectan las amenazas planteadas por patógenos, alérgenos y contaminantes2
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Protocolo
Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Montreal (#22053, #22054) aprobaron todos los procedimientos con animales. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de soluciones y su composición y la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales , equipos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Aislamiento, cultivo y estimulación de células NK
- Generar neurona nociceptora intacta (control de camada; Ratones TRPV1 wt::D TA fl/wt) y ablacionados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando ratones con toxina lox-stop-lox-diftérica (DTA fl/fl
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Resultados
Las células NK se purificaron magnéticamente a partir de esplenocitos de ratones de control de camada (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) y estimulados (48 h) con IL-2 e IL-15. Las células NK se cultivaron solas o cocultivadas con neuronas DRG recolectadas de la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt). Luego, las células se expusieron al agonista capsaicina TRPV1 (1 μM) o su vehícu.......
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Discusión
Davies et al.11 encontraron que las neuronas lesionadas regulan al alza la RAE1. A través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D fueron capaces de identificar y eliminar las neuronas RAE1+ , que a su vez limitan el dolor crónico11. Dado que las células NK también expresan varios receptores de neuropéptidos, y que esos neuropéptidos son conocidos por sus capacidades inmunomoduladoras, parece cada vez más importante estudiar la inter.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (162211, 461274, 461275), la Fundación Canadiense para la Innovación (37439), el programa de la Cátedra de Investigación de Canadá (950-231859), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2019-06824) y el Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-ratón CD16/32 | Laboratorio Jackson Nº | cat: 017769 | |
| B-27 | Laboratorio Jackson | Nº de gato: 009669 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) grado de cultivo | World Precision Instruments | Nº de cat: 504167 | |
| BV421 anti-ratón NK-1.1 | Fisher Scientific | Nº de gato: 12430112 | |
| Filtro de células (50 μ m) | Fisher Scientific | Cat n.º: A3160702 | |
| Colagenasa IV | Fisher | Scientific Cat n.º: 15140148 | |
| Dipteria toxinfl/fl | Fisher | Scientific Cat n.º: SH3057402 | |
| Dispasa II | Fisher Scientific | Cat n.º: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat n.º: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Kit de aislamiento de células | Sigma | Nº de gato: CLS2595 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma | Nº de gato: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Nº de gato: 04942078001 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma | Nº de gato: 806552 | |
| FITC antiratón NKp46 | Sigma | Nº de gato: L2020 | |
| Placa de 96 pocillos de fondo plano | Sigma | Nº de cat: 03690 | |
| Pipeta Pasteur de vidrio | Sigma | Nº de cat: 470236-274 | |
| Factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF) | VWR | Nº de cat: 02-0131 | |
| Laminina | Cedarlán | Nº de cat: 03-50/31 | |
| L-Glutamina | Gibco | Nº de cat: A14867-01 | |
| Ratón IL-15 recombinante | Gibco | Nº de cat: 22400-089 | |
| Ratón recombinante IL-2 | Gibco | Nº de cat: 21103-049 | |
| Factor de crecimiento nervioso (NGF) | Life Technologies | Nº de cat: 13257-019 | |
| Medios neurobasales | PeproTech | Nº de cat: 450-51-10 | |
| PE anti-ratón GM-CSF | PeproTech | Nº de cat: 212-12 | |
| Penicilina y Estreptomicina | PeproTech | Nº de cat: 210-15 | |
| células madre | Mortles | Nº de cat: 19855 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Biolegend | Nº de gato: | 108732 Clon PK136 |
| RPMI 1640 medios | Biolegend | Nº de gato: | 137606 Clon 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Nº de gato: 505406 | Clon MP1-22E9 |
| Pinzas y herramientas de disección. | Biolegend | Nº de cat: 65-0865-14 | |
| Placa de 96 pocillos con fondo en U | Biolegend | Nº de gato: 101319 | |
| Tinte de viabilidad eFlour-780 | Becton Dickinson |
Referencias
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al.
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Reimpresiones y permisos
