Describimos un enfoque para medir los cambios en la eficiencia fotosintética en plantas después del tratamiento con bajoCO2 utilizando fluorescencia de clorofila.
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Artículo de método
Evaluación de la eficiencia fotosintética en mutantes fotorrespiratorios mediante análisis de fluorescencia de clorofila
En este artículo
Resumen
Resumen
La fotosíntesis y la fotorrespiración representan los mayores flujos de carbono en el metabolismo primario de las plantas y son necesarios para la supervivencia de las plantas. Muchas de las enzimas y genes importantes para la fotosíntesis y la fotorrespiración han sido bien estudiados durante décadas, pero algunos aspectos de estas vías bioquímicas y su diafonía con varios procesos subcelulares aún no se comprenden completamente. Gran parte del trabajo que ha identificado los genes y proteínas importantes en el metabolismo de las plantas se ha llevado a cabo en entornos altamente controlados que pueden no representar mejor cómo funcionan la fotosíntesis y la fotorrespiración en entornos naturales y agrícolas. Teniendo en cuenta que el estrés abiótico resulta en una eficiencia fotosintética deteriorada, es necesario el desarrollo de una pantalla de alto rendimiento que pueda monitorear tanto el estrés abiótico como su impacto en la fotosíntesis.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método relativamente rápido para detectar cambios inducidos por el estrés abiótico en la eficiencia fotosintética que puede identificar genes no caracterizados con roles en la fotorrespiración utilizando el análisis de fluorescencia de clorofila y la detección de bajoCO2 . Este artículo describe un método para estudiar los cambios en la eficiencia fotosintética en mutantes knockout de ADN transferido (ADN-T) en Arabidopsis thaliana. El mismo método se puede utilizar para la detección de mutantes inducidos por metanosulfonato de etilo (EMS) o la detección de supresores. La utilización de este método puede identificar candidatos a genes para un estudio adicional en el metabolismo primario de las plantas y las respuestas al estrés abiótico. Los datos de este método pueden proporcionar información sobre la función de los genes que puede no reconocerse hasta la exposición a entornos de mayor estrés.
Introducción
Las condiciones de estrés abiótico comúnmente observadas en los campos de los agricultores pueden afectar negativamente los rendimientos de los cultivos al reducir la eficiencia fotosintética. Las condiciones ambientales perjudiciales, como las olas de calor, el cambio climático, la sequía y la salinidad del suelo, pueden causar estrés abiótico que altera la disponibilidad deCO2 y reduce la respuesta de una planta al alto estrés lumínico. Los dos flujos de carbono terrestres más grandes son la fotosíntesis y la fotorrespiración, que son esenciales para el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos. Muchas de las proteínas y enzimas importan....
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Protocolo
1. Preparación y esterilización de semillas
NOTA: La preparación de semillas consiste en la ingesta de semillas y la esterilización de semillas. Es importante tener en cuenta que todos estos pasos deben llevarse a cabo en una campana de flujo laminar para mantener las condiciones estériles. Todos los materiales, reactivos y medios de crecimiento necesarios deben ser esterilizados en autoclave (consulte la Tabla de materiales).
- Imbibación y estratificación de semillas
NOTA: Las líneas de semillas utilizadas son plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) y tipo silvestre (WT, C....
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Resultados
Los resultados muestran imágenes de placas de imágenes crudas y fluorescentes de detección ambiental y baja deCO2 de WT y mutantes de prueba. Cada plántula está etiquetada por número de área, con las lecturas de fluorescencia correspondientes dadas como QY. Los datos se exportan como un archivo de texto y se pueden abrir en una hoja de cálculo para su análisis (consulte la Tabla suplementaria S1). Se seleccionaron las líneas mutantes plgg1-1 y abcb26 para demostrar la identif.......
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Discusión
Los métodos experimentales descritos en este documento vienen con algunas ventajas y limitaciones. Una ventaja es que este método puede examinar muchas plántulas de plantas, aunque se deben tomar algunas precauciones para evitar la contaminación de la placa de medios vegetales durante el proceso de recubrimiento y crecimiento. Por lo tanto, es fundamental sellar las placas de Arabidopsis con cinta quirúrgica. Otra ventaja de este experimento es que tiene un período de estrés fotorrespiratorio más corto de 12 h en compara.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia ni conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Junta de Regentes de Louisiana (AWD-AM210544).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Contenedor | VWR 10810-070 | para la esterilización de semillas | |
| agarosa | VWR | 9012-36-6 | producto químico utilizado para suspender semillas para facilitar el enchapado |
| Arabidopsis thaliana semillas (abcb26) | ABRC, pedido a través de TAIR | www.arabidopsis.org SALK_085232 | semillas de arabidopsis utilizadas como grupo experimental |
| Arabidopsis thaliana semillas (plgg1-1) | ABRC, ordenadas a través de TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | semillas parentales de arabidopsis |
| Arabidopsis thaliana semillas (WT) | ABRC, ordenadas a través de TAIR www.arabidopsis.org | semillas de tipo silvestre Col-0 | arabidopsis utilizadas como grupo de control |
| lejía | clorox lejía genérica | Producto químico utilizado para esterilizar semillas | |
| Absorbente de carbolima | Productos Medline | S232-104-001 | Absorbente de CO2 |
| Cerrado FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Generador de imágenes de fluorescencia |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Cerrado FluorCam FC 800-C/1010-S Generador de | imágenes de fluorescencia |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Cerrado FluorCam FC 800-C/1010- S | Software de análisis de imágenes de fluorescencia |
| Gelzan (agar vegetal) | Phytotech labs | 71010-52-1 | químico utilizado para solidificar medios MS como placas |
| matraz de vidrio 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | contenedor para la fabricación y esterilización en autoclave |
| MS media cámara de crecimiento | caron | 7317-50-2 | cámara de crecimiento utilizada para el cultivo de plantas |
| Murashige & Skoog Medio Basal con Vitaminas & 1.0 g/L MES (MS)Laboratorios | de fitotecnología | M5531 | medios de crecimiento para plántulas de Arabidopsis |
| hidróxido de potasio (KOH) | Los laboratorios de fitotecnología | 1310-58-3 | fabrican una solución de 1 M para |
| Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | luces utilizadas en el ensayo de luz | |
| Placa de Petri cuadrada con rejilla, estéril | Simport Scientific | D21016 | utilizada para sostener medios de MS para plántulas de arabidopsis |
| cinta quirúrgica | 3M | 1530-1 | cinta utilizada para sellar placas |
| entre 20 | biorad | 9005-64-5 | Surfactante utilizado para ayudar a la esterilización de semillas |
Referencias
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 ....
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Reimpresiones y permisos
