Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

Los astrocitos son células elaboradamente ramificadas que realizan muchas funciones importantes en el cerebro¹. En la corteza del ratón, las células madre gliales radiales dan lugar a astrocitos durante las etapas embrionaria tardía y postnatal temprana². Durante las tres primeras semanas postnatales, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad, desarrollando miles de ramas finas que interactúan directamente con las sinapsis¹. Al mismo tiempo, los astrocitos interactúan con los astrocitos vecinos para establecer territorios discretos y no superpuestos para alicatar el cerebro³, mientras mantienen la comunicación a través de los canales de unión^{de brecha 4}. La morfología y la organización de los astrocitos se interrumpen en muchos estados de enfermedad después de un insulto o lesión⁵, lo que indica la importancia de estos procesos para la función cerebral adecuada. El análisis de las propiedades morfológicas de los astrocitos durante el desarrollo normal, el envejecimiento y la enfermedad puede proporcionar información valiosa sobre la biología y la fisiología de los astrocitos. Además, el análisis de la morfología de los astrocitos después de la manipulación genética es una herramienta valiosa para discernir los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan el establecimiento y mantenimiento de la complejidad morfológica de los astrocitos.

El análisis de la morfología de los astrocitos en el cerebro del ratón se complica tanto por la complejidad de la ramificación de los astrocitos como por el mosaico de los astrocitos. La tinción de anticuerpos utilizando la proteína ácida fibrilar glial de filamento intermedio (GFAP) como marcador específico de astrocitos captura solo las ramas principales y subestima enormemente la complejidad morfológica de los astrocitos¹. Otros marcadores específicos de la célula, como el transportador de glutamato 1 (GLT-1; slc1a2), la glutamina sintetasa o la S100β, hacen un mejor trabajo al etiquetar las ramas de astrocitos⁶, pero introducen un nuevo problema. Los territorios de los astrocitos no se superponen en gran medida, pero existe un pequeño grado de superposición en los bordes periféricos. Debido a la complejidad de la ramificación, cuando los astrocitos vecinos se etiquetan del mismo color, es imposible distinguir dónde termina un astrocito y comienza el otro. El etiquetado disperso o en mosaico de astrocitos con proteínas fluorescentes endógenas resuelve ambos problemas: el marcador fluorescente llena la célula para capturar todas las ramas y permite obtener imágenes de astrocitos individuales que se pueden distinguir de sus vecinos. Se han utilizado varias estrategias diferentes para lograr un etiquetado fluorescente escaso de astrocitos, con o sin manipulación genética, incluida la inyección viral, la electroporación de plásmidos o las líneas de ratones transgénicos. Los detalles sobre la ejecución de estas estrategias se describen en estudios y protocolos publicados previamente ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

Este artículo describe un método para medir el volumen del territorio de astrocitos de cerebros de ratón con marcado fluorescente en una población escasa de astrocitos (Figura 1). Debido a que el diámetro promedio de un astrocito en la corteza del ratón es de aproximadamente 60 μm, se utilizan secciones de 100 μm de espesor para mejorar la eficiencia en la captura de astrocitos individuales en su totalidad. No se requiere inmunotinción, pero se recomienda para mejorar la señal fluorescente endógena para imágenes y análisis confocales. La inmunotinción también puede permitir una mejor detección de ramas finas de astrocitos y reducir el fotoblanqueo de proteínas endógenas durante la adquisición de imágenes. Para mejorar la penetración de anticuerpos en las secciones gruesas y para preservar el volumen de tejido de la sección a través de imágenes, se utilizan secciones de tejido que flotan libremente. El análisis del volumen del territorio de los astrocitos se realiza utilizando un software de análisis de imágenes disponible comercialmente. Además, este protocolo describe un método para el análisis de mosaicos de astrocitos en secciones de tejido con marcado en mosaico, donde los astrocitos vecinos expresan diferentes etiquetas fluorescentes. Este protocolo se ha utilizado con éxito en varios estudios recientes ^1,8,9 para caracterizar el crecimiento de astrocitos durante el desarrollo normal del cerebro, así como el impacto de la manipulación genética en el desarrollo de astrocitos.

Todos los ratones se utilizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y la División de Medicina Comparada (número de protocolo IACUC 21-116.0). Se utilizaron ratones de ambos sexos en el día postnatal 21 (P21) para estos experimentos. Los ratones CD1 se obtuvieron comercialmente (Tabla de Materiales), y los ratones MADM9 WT:WT y MADM9 WT:KO fueron descritos previamente⁹.

NOTA: Este protocolo requiere cerebros con expresión de proteínas fluorescentes en una población escasa de astrocitos. La expresión de proteínas fluorescentes se puede introducir genéticamente, viralmente o por electroporación. Los detalles de los métodos para etiquetar escasamente los astrocitos se describen en estudios y protocolos publicados anteriormente ^{1,7,8,9,10,11,12,13}.

1. Recolección y preparación de tejidos

PRECAUCIÓN: El paraformaldehído (PFA) es un producto químico peligroso. Realice todos los pasos con PFA en una campana de humos químicos.

1. Anestesiar ratones con un anestésico inyectable (por ejemplo, Avertin; 0,8 mg/kg) y asegurar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Use una bomba peristáltica para realizar la perfusión intracardíaca con solución salina tamponada Tris (TBS) + heparina helada a una velocidad de ~ 3 ml / min hasta que el hígado esté limpio (generalmente 3-5 min), seguido de PFA al 4% helado en TBS a una velocidad de ~ 3 ml / min durante 5 min.
   NOTA: El caudal y los tiempos están optimizados para ratones postnatales del día 21 (P21). Es posible que se necesiten ajustes en la velocidad de flujo y el tiempo de perfusión para ratones de diferentes edades.
2. Después de la perfusión, use un par de tijeras operativas para separar la cabeza y quitar la piel para exponer el cráneo. A continuación, use un par de tijeras de microdisección para extraer la parte superior del cráneo y exponer el cerebro. Use un par de fórceps o una pequeña espátula para extraer el cerebro y transfiéralo a un tubo que contenga PFA al 4% helado e incube durante la noche a 4 ° C.
   NOTA: Asegúrese de usar un tubo con un fondo plano, como un vial de centelleo de 7 ml, para que el cerebro no se encaje en la parte inferior del tubo, lo que podría comprimir el tejido y alterar el volumen de los astrocitos.
3. Al día siguiente, vierta el PFA del tubo. Agregue 5 ml de 1 tbs al tubo para enjuagar el cerebro y eliminar el PFA residual. Vierta el TBS y repita este proceso dos veces más para un total de tres enjuagues.
4. Agregue 4-5 ml de sacarosa al 30% en TBS e incube el cerebro a 4 ° C durante 1-2 días, o hasta que el cerebro se hunda en el fondo del tubo.
   NOTA: Los cerebros están listos para congelarse una vez que se han hundido, pero se pueden almacenar en solución de sacarosa a 4 ° C durante varias semanas.
5. Prepare el medio de congelación en un tubo de 50 ml mezclando 15 ml de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) al 100% con 30 ml de sacarosa al 30% en TBS. Mezcle en un nutator o un agitador orbital durante al menos 1 h para garantizar que la solución esté completamente mezclada. Mantenga el tubo en posición vertical durante una hora adicional para permitir que las burbujas suban a la superficie.
   NOTA: El medio de congelación se puede preparar con anticipación y almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas.
6. Use una pipeta serológica para agregar medio de congelación a un molde de incrustación cuadrado (Tabla de materiales). Tenga cuidado de evitar introducir burbujas en el medio. Para un cerebro de ratón P21, 3 ml es suficiente. Ajuste el volumen según sea necesario para diferentes edades para que el cerebro esté completamente sumergido.
7. Agregue el cerebro al medio y use un par de fórceps # 5 para eliminar cualquier tronco cerebral que pueda estar impidiendo que el cerebro se siente plano en el molde. Alinea la parte frontal del cerebro con un borde del molde.
8. Transfiera el molde a una superficie plana enfriada con hielo seco. Una lata de almuerzo de metal llena de hielo seco funciona bien para este propósito. Rodea el molde con gránulos de hielo seco para asegurar una congelación lenta y uniforme.
9. Una vez que el medio de congelación esté completamente blanco y sólido, guarde el molde a -80 °C.
   NOTA: Los cerebros se pueden almacenar a -80 °C durante varios años.

2. Ciroseccionación

NOTA: Este método de seccionamiento está destinado a trabajar con muchos criostatos diferentes disponibles comercialmente. Con el criostato utilizado aquí (Tabla de Materiales), la temperatura óptima de corte de la cabeza de la muestra es de -23 ° C, con una temperatura de la cámara ambiente entre -23 ° C y -25 ° C.

PRECAUCIÓN: La hoja de criostato es extremadamente afilada. Tenga cuidado al manipular la cuchilla y operar el criostato.

1. Prepare el medio de seccionamiento mezclando 25 ml de 1x TBS y 25 ml de glicerol en un tubo de 50 ml. Es más fácil agregar el glicerol vertiéndolo directamente en el tubo y usando los marcadores en el tubo para la medición. Agite/vórtice el tubo para mezclar. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas.
2. Prepárese para recolectar secciones de tejido agregando 2 ml de medio de seccionamiento por pozo a una placa de 12 pocillos. Etiquete la parte superior e inferior de la placa con información de muestra. Coloque la placa, junto con otros suministros (hoja de criostato, hoja de afeitar, mandriles y pinceles), directamente en el criostato, y permita que se aclimaten a la temperatura durante ~ 5 min.
3. Mueva los cerebros a la cámara de criostato y permita que se aclimaten a la temperatura junto con los suministros.
4. Retire el bloque de tejido congelado del molde cortando dos esquinas del molde con una cuchilla de afeitar y pelando el molde lejos del tejido. Oriente el bloque de modo que la parte frontal del cerebro esté orientada hacia arriba.
5. Agregue OCT al mandril de tal manera que ~ 2/3 del mandril esté cubierto con OCT e inmediatamente coloque el bloque de tejido en el mandril, manteniendo la orientación descrita anteriormente. Presione el bloque hacia abajo en la OCT para que quede plano en la superficie del mandril.
6. Una vez que la OCT esté completamente congelada y el bloque de tejido esté firmemente en su lugar, sujete el mandril a la cabeza de la muestra. Inserte la cuchilla del criostato y acerque la cuchilla a la muestra.
7. Recorte a través del cerebro a intervalos de 100 μm hasta justo antes de que se alcance la región cerebral de interés. Para reducir la cantidad de OCT que se disuelve en el medio de seccionamiento, use una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de medio de congelación de los lados del bloque de tejido.
8. Una vez que se alcanza la región de interés, comience a recolectar secciones de 100 μm de espesor. Recoge secciones usando la placa estabilizadora o avanzando lentamente el criostato con una mano mientras usas un pincel en la otra mano para guiar la sección fuera del bloque a medida que se encuentra con la cuchilla. Si el modelo de criostato tiene un pedal, use el pedal para avanzar el criostato de modo que se puedan usar ambas manos para guiar la sección fuera del bloque.
9. Transfiera las secciones a la placa de 12 pocillos con un pincel o fórceps. Cada pozo puede contener al menos 10-12 secciones. Al agregar la sección al medio, generalmente es suficiente tocar el borde inferior de la sección al medio de seccionamiento y permitir que la sección se derrita en el medio sin mojar el cepillo o las pinzas. Si el cepillo toca el medio, asegúrese de secarlo con una toalla de papel o pañuelo de papel, ya que un cepillo demasiado húmedo dificultará la transferencia de secciones de tejido.
10. Asegure la placa envolviéndola con papel de aluminio o película de parafina. Asegúrese de etiquetarlo claramente, luego guárdelo a -20 ° C.
    NOTA: Para la mayoría de los protocolos de tinción, las secciones se pueden almacenar a -20 °C durante al menos 1-2 años sin pérdida sustancial de señal.

3. Inmunotinción

NOTA: Realice todos los lavados e incubaciones en un agitador de plataforma orbital ajustado a aproximadamente 100 rpm. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente, excepto la incubación primaria de anticuerpos, que se realiza a 4 °C. Prepare los medios de montaje con anticipación combinando los ingredientes en un tubo de 50 ml y mezclándolos en un nutator durante la noche. Proteger de la luz y conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Si la señal fluorescente endógena es suficiente para la obtención de imágenes y el análisis sin necesidad de inmunotinción, se pueden omitir los pasos 3.1-3.9. Si se salta la inmunotinción, realice tres lavados de 10 minutos en TBS y continúe con el paso 3.10.

1. Prepare una solución fresca de TBST (0.2% Triton en TBS) agregando 1 mL de Triton-X al 10% a un tubo de 50 mL y llenando el tubo a 50 mL con 1x TBS. Prepare 2 mL de soluciones de bloqueo y anticuerpos (10% de suero de cabra en TBST) para cada cerebro.
   NOTA: Para obtener los mejores resultados, haga TBST fresco para cada nuevo experimento de tinción y use una fuente de alta calidad de Tritón-X acuoso al 10% (Tabla de materiales).
2. Etiquete una placa de 24 pocillos de acuerdo con el esquema (Figura 1). Coloque diferentes muestras en diferentes filas y diferentes soluciones en diferentes columnas. Agregue 1 ml de TBST a las tres primeras columnas ('Lavado 1', 'Lavado 2' y 'Lavado 3'). Agregue 1 ml de solución de bloqueo a la cuarta columna.
3. Prepare una selección de vidrio derritiendo el extremo de una pipeta Pasteur 5.75 en un pequeño gancho usando un quemador Bunsen. Use esta selección para transferir secciones de tejido de la placa de 12 pocillos a la columna Wash 1 de la placa de 24 pocillos.
   NOTA: Para obtener los mejores resultados, revise las secciones antes de comenzar a teñir. Para examinar las secciones, transfiera las secciones una por una a una placa de Petri llena de 1x TBS y examine las secciones usando un microscopio fluorescente con un objetivo de 5x o 10x para garantizar que haya un número adecuado de células marcadas fluorescentemente. Se recomienda teñir de cuatro a seis secciones por pozo, aunque se pueden teñir hasta ocho por pozo si es necesario.
4. Lave las secciones durante 10 minutos cada una en los pocillos Wash 1, 2 y 3, seguido de incubar las secciones durante 1 h en la solución de bloqueo. Use la púa de vidrio para transferir las secciones de un pozo a otro. La selección se puede utilizar para transferir múltiples secciones del cerebro a la vez.
5. Prepare 1 ml de solución de anticuerpos primarios para cada muestra (por ejemplo, Rabbit RFP 1: 2000 o Chicken GFP 1: 2000). Agregue el anticuerpo a la solución de anticuerpos, el vórtice brevemente y luego centrifugue durante 5 minutos a ≥ 4,000 x g a 4 ° C. Incubar las secciones en anticuerpo primario durante dos o tres noches a 4 °C mientras agita.
6. Después de la incubación primaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 1 de los pozos de lavado, agregue 1 ml de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado. Lave las secciones 3x durante 10 minutos cada una.
   NOTA: Para la aspiración, utilice una pipeta 9 en Pasteur conectada con la tubería a un matraz de vacío. Las líneas de vacío de la casa o una bomba de vacío eléctrica se pueden utilizar como fuente de vacío.
7. Mientras se lavan las secciones, prepare soluciones de anticuerpos secundarios a una concentración de 1:200 agregando anticuerpos a la solución de anticuerpos (por ejemplo, cabra anti-conejo 594 o cabra anti-pollo 488). Vórtice brevemente, y luego gire durante 5 min a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
8. Incubar secciones en anticuerpo secundario durante 3 h a temperatura ambiente. Proteja las secciones de la luz durante este paso y todos los pasos siguientes para mitigar el blanqueamiento de los anticuerpos secundarios.
9. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 2 de los pozos de lavado, agregue 1 ml de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado. Lave las secciones 3x en TBST durante 10 minutos cada una.
10. Durante el lavado final, saque el soporte de montaje a 4 °C y deje que se caliente a temperatura ambiente. Prepare una mezcla 2:1 de 1x TBS:dH₂O y agréguela a una placa de Petri. Prepare un portaobjetos de microscopio agregando 800 μL de 2:1 TBS:dH₂O a la superficie.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente el uso de medios de montaje sin curado. Los medios de montaje de endurecimiento pueden alterar el volumen del tejido, lo que puede confundir el análisis del volumen del territorio de los astrocitos. Una receta para un medio de montaje casero simple y económico se proporciona en la Tabla de materiales.
11. Usando un pincel fino, transfiera las secciones una a la vez del pozo Wash 3 a la placa de Petri. Este paso elimina el tritón y ayuda a que las secciones se aplanen. A continuación, transfiera las secciones de la placa de Petri al líquido en la diapositiva.
12. Use un pincel para ayudar a organizar las secciones de modo que queden planas en la diapositiva. Retire con cuidado el exceso de líquido de la corredera con una pipeta P1000, seguida de aspiración al vacío.
    NOTA: Agregue una punta de pipeta P200 al extremo de la pipeta Pasteur para un control más fino de la aspiración al vacío.
13. Una vez que se elimine todo el exceso de líquido de la diapositiva, use una pipeta de transferencia para agregar inmediatamente una gota de medios de montaje a cada sección y coloque suavemente una cubierta sobre la diapositiva. Deje que el soporte de montaje se extienda durante unos minutos y, a continuación, retire cualquier exceso de soporte de montaje que salga de debajo de la cubierta por aspiración al vacío.
    NOTA: No permita que las secciones se sequen antes de agregar el soporte de montaje. Si las secciones comienzan a secarse antes de agregar medios de montaje, esto puede afectar el volumen de tejido e impedir la recopilación precisa de datos.
14. Selle los cuatro bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Deje que los toboganes se sequen durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego guárdelos planos a 4 °C. Espere al menos 2 h antes de obtener la imagen, o, la imagen al día siguiente.
    NOTA: Las secciones teñidas con anticuerpos contra GFP y RFP se pueden almacenar hasta 2 semanas antes de la obtención de imágenes, siempre que estén completamente selladas con esmalte de uñas.

4. Imágenes confocales

NOTA: Este protocolo proporciona pautas generales de adquisición de imágenes que son ampliamente aplicables a diferentes microscopios confocales, en lugar de detalles específicos para una interfaz confocal y de software en particular.

1. Utilice un objetivo 10x para localizar células individuales para obtener imágenes, tomando nota de la región o subregión específica del cerebro (por ejemplo, la capa 5 de la corteza visual) según sea relevante para el experimento. Use la perilla de enfoque para tratar de determinar si todo el astrocito está contenido dentro de la sección.
2. Cambie a un objetivo de aceite de aumento más alto (por ejemplo, 40x, 60x o 63x) y enfoque la célula. Mientras mira a través del ocular, use la perilla de enfoque para moverse de la parte superior a la inferior de la celda.
   1. Inspeccione visualmente la celda para asegurarse de que toda la celda está contenida dentro de la sección. Si la celda se desenfoca abruptamente y se corta en el borde de la sección, excluya esta celda y ubique otra.
3. Utilizando el software de adquisición asociado al microscopio confocal, ajuste los parámetros de adquisición para obtener una relación señal-ruido y un nivel de detalle adecuados (la resolución de 512 x 512 proporcionará suficiente detalle para el análisis del territorio y reducirá el tiempo de adquisición de la imagen). Use un zoom de 2x si usa un objetivo de 40x, y no haga zoom si usa un objetivo de 60x o 63x.
4. Establezca los límites superior e inferior de la pila z. Para asegurarse de que se está capturando todo el astrocito, la primera y la última imagen de la pila z no deben contener ningún etiquetado fluorescente de la célula. Para un muestreo adecuado, utilice un tamaño de paso de 0,5 μm.

5. Análisis de imágenes

NOTA: Este protocolo describe los pasos para realizar el análisis de imágenes utilizando el software de análisis de imágenes disponible comercialmente (es decir, Imaris; consulte la Tabla de materiales). Se pueden utilizar otras versiones de este software con modificaciones menores en el flujo de trabajo. Este protocolo también requiere que MATLAB ejecute el archivo Convex Hull XTension (archivo suplementario).

1. Antes de comenzar el análisis, instale el archivo Convex Hull XTension XTSpotsConvexHull.m pegando el archivo en la subcarpeta rtmatlab de la carpeta XT.
2. Utilice el convertidor de archivos Imaris para convertir imágenes al formato '.ims'. Abra un archivo de imagen en el software de análisis de imágenes y vea la imagen en el modo de visualización 3D seleccionando el botón Vista 3D .
3. Antes del análisis, inspeccione la celda para asegurarse de que cumple con los criterios de inclusión.
   1. Asegúrese de que toda la celda esté presente dentro de la imagen (es decir, no se debe cortar ninguna parte de la celda de la imagen). Gire la imagen para inspeccionar los bordes delantero y posterior.
   2. Asegúrese de que la célula tenga un solo cuerpo celular. Haga clic en el botón Slice , arrastre el cursor a la izquierda de la pantalla para moverse a través de la pila z y verifique que la celda etiquetada contenga solo un cuerpo de celda.
   3. Asegúrese de que haya un astrocito individual que se pueda distinguir de cualquier astrocito vecino que esté etiquetado con el mismo color.
4. Crear una superficie
   1. Con el botón Vista 3D seleccionado de nuevo, cree una nueva superficie haciendo clic en el icono azul Agregar nuevas superficies .
      1. En la pestaña Crear que aparece en la parte inferior izquierda de la ventana del software, asegúrese de que solo las casillas Segmentar solo una región de interés y Estadísticas de objeto-objeto estén marcadas para Configuración del algoritmo, y que la casilla Iniciar creación con vista de segmentación de datos para Preferencias de creación esté desactivada. Haga clic en la flecha azul para continuar.
         NOTA: Es posible que no se necesite una región de interés si no hay una señal fluorescente adicional en la imagen fuera de la celda de interés. En este caso, deje sin marcar Segmentar solo una región de interés y continúe con el paso 5.4.3.
   2. Cree una región de interés alrededor de la celda introduciendo cotas en los cuadros de la herramienta Creación de superficies o arrastrando los bordes del cuadro amarillo (Figura 2A). Haga clic en la flecha azul para continuar.
   3. Seleccione el canal de origen correcto en la lista desplegable para su análisis (por ejemplo, el canal 1 o el canal que contiene el relleno de celda fluorescente). El valor del cuadro Detalle de superficies está determinado por el software y en función de los parámetros de adquisición de imágenes. Asegúrese de que este valor permanezca constante para todas las muestras del experimento. Haga clic en la flecha azul para continuar.
   4. Ajuste el Umbral (Intensidad Absoluta) arrastrando la barra amarilla o introduciendo valores en el cuadro para que la superficie gris llene la mayor cantidad posible de la señal de la celda sin ir más allá del límite de la celda. Una pequeña cantidad de señal fluorescente será visible en los bordes de la superficie (Figura 2B). Haga clic en la flecha azul para continuar.
   5. El último panel de la herramienta Creación de superficies establece el valor de calidad mínimo, que es el valor predeterminado de umbral inferior del software. En la lista desplegable, asegúrese de que Número de vóxeles Img=1 esté seleccionado. Compruebe que solo el botón de encendido izquierdo para El umbral inferior esté verde (activo); el botón de encendido derecho debe ser rojo (inactivo). El software establece de forma predeterminada el valor de umbral inferior en 10. Deje esto sin cambios y haga clic en la flecha verde para terminar de generar la superficie.
   6. Inspeccione cuidadosamente la superficie recién generada. Elimine cualquier elemento de superficie que no forme parte de la celda seleccionándolos, haciendo clic en la herramienta Editar con lápiz y haciendo clic en la opción Eliminar .
   7. Unifique las piezas de superficie restantes haciendo clic en el icono filtro del embudo para seleccionar todo, haciendo clic en el icono Editar del lápiz y haciendo clic en la opción Unificar (Figura 2C).
      NOTA: Con un archivo de imagen grande, el software puede bloquearse ocasionalmente durante los pasos posteriores de este protocolo. Es una buena idea guardar el archivo en este punto.
5. Generar manchas cercanas a la superficie
   1. Haga clic en el icono naranja Agregar nuevos spots . Con los nuevos Puntos (por ejemplo, "Puntos 1") seleccionados, en la pestaña Crear , asegúrese de que solo la casilla Estadísticas objeto-objeto esté marcada para Configuración del algoritmo y que la casilla Iniciar creación con vista de segmentación de datos para Preferencias de creación esté desactivada. Haga clic en la flecha azul para continuar.
   2. Seleccione el canal de origen correcto en la lista desplegable (por ejemplo, canal 1) y, a continuación, introduzca un valor de diámetro XY estimado de 0,400 μm en el cuadro. Asegúrese de que solo esté seleccionado el cuadro Sustracción en segundo plano . Haga clic en la flecha azul para continuar.
      NOTA: 0,400 μm es apropiado para imágenes de 1024 x 1024 o 512 x 512 con objetivos de 63x, 60x o 40x. Para otras condiciones de imagen, el diámetro debe determinarse en función de las condiciones de imagen y permanecer constante durante todo el análisis. El valor apropiado creará suficientes puntos para cubrir toda la señal positiva, pero no agregará puntos en la señal de fondo.
   3. El último panel de la herramienta Creación de manchas establece el valor de calidad mínimo, que es el valor predeterminado del umbral inferior del software; asegúrese de que este valor permanezca sin cambios a menos que haya una diferencia notable en la colocación / distribución de las manchas (por ejemplo, debido a una tinción de peor calidad). Haga clic en la flecha verde para terminar de crear las manchas.
   4. Para ver mejor las manchas, cambie la transparencia de la superficie seleccionando Superficie y haciendo clic en la herramienta Color multicolor. En Material, seleccione el material que hace que la superficie sea lo suficientemente transparente como para ver los puntos en toda la celda (el cuarto al último material de la lista) (Figura 2D, E).
   5. Vuelva a seleccionar los puntos, haga clic en el icono Filtro y seleccione Distancia más corta a superficies Superficies=Superficies X, donde 'Superficies X' es la superficie que se está analizando (por ejemplo, Superficies 1), en la lista desplegable. Asegúrese de que los botones de encendido Umbral inferior y Umbral superior estén verdes (activos).
      1. Introduzca una distancia mínima de -1,0 μm (distancia de los puntos desde el interior de la superficie) en el cuadro Umbral inferior y una distancia máxima de 0,1 μm (distancia desde el exterior) en el cuadro Umbral superior . Haga clic en el botón Duplicar selección a nuevos puntos para terminar de generar puntos cerca de la superficie.
         NOTA: Los valores de distancia mínima y máxima pueden variar con diferentes parámetros de adquisición de imágenes, como el objetivo, el zoom y la resolución. Estos números deben determinarse empíricamente. La superficie transparente ayuda a juzgar si los valores capturan todos los puntos que representan con precisión la forma de la superficie.
6. Generar casco convexo y recoger mediciones de territorio
   1. Asegúrese de que los Spots recién creados estén seleccionados en el panel superior izquierdo de la ventana del software (por ejemplo, "Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]"). Haga clic en el icono herramientas de engranaje y luego en el complemento Convex Hull . Haga clic en el complemento solo una vez y espere a que aparezca la ventana de MATLAB y luego desaparezca (esto puede tardar varios segundos). Un casco sólido aparecerá en la vista 3D.
   2. En el panel superior izquierdo, seleccione Casco convexo de spots X Selection ['Distancia más corta...], donde 'Spots X Selection' son los puntos recién creados (por ejemplo, Spots 1 Selection), y luego haga clic en el casco para seleccionarlo (Figura 2F).
   3. Haga clic en el icono Estadísticas del gráfico, elija la pestaña Selección , asegúrese de que Valores específicos esté seleccionado en la lista desplegable superior y, a continuación, elija Volumen en la lista desplegable inferior. Registre el volumen del casco. Guarde el archivo y continúe con la siguiente imagen.
7. Medición del volumen de superposición de territorios para células vecinas con diferentes etiquetas fluorescentes
   NOTA: Esta sección del protocolo se puede usar si las muestras contienen astrocitos vecinos que expresan etiquetas fluorescentes distintas (por ejemplo, Astrocyte 1 expresa GFP solo y Astrocyte 2 expresa RFP solamente). Este etiquetado se logró utilizando estrategias virales o genéticas como se describió anteriormente ^9,10 (Figura 3A).
   1. Usando los pasos detallados en los pasos 5.4-5.6, cree la superficie, las manchas cercanas a la superficie y el casco convexo para cada astrocito (Figura 3B).
   2. Con Convex Hull of Spots 1 Selection... seleccionado, haga clic en el icono Editar a lápiz y haga clic en Selección de máscara. En la ventana Canal de máscara , asegúrese de que el canal 1 (o el canal que representa el astrocito 1) esté seleccionado y asegúrese de que la casilla junto al canal duplicado antes de aplicar la opción de máscara esté marcada. Haga clic en Aceptar para crear el canal Masked CH1.
   3. Con casco convexo de spots 2 selección... seleccionado, haga clic en el icono Editar del lápiz y haga clic en Selección de máscara. En la ventana Canal de máscara , seleccione Canal 2 (o el canal que representa el astrocito 2) en el menú desplegable y asegúrese de que la casilla junto al canal duplicado antes de aplicar la opción máscara esté marcada. Haga clic en Aceptar para crear el canal CH2 enmascarado (Figura 3C).
   4. Haga clic en el botón Coloc en la parte superior de la pantalla y use la herramienta Coloc para crear un canal de colocalización de los dos canales enmascarados. Establezca el Canal A en el Canal 3 - CH1 enmascarado y el Canal B en el Canal 4 - CH2 enmascarado (Figura 3D).
   5. Arrastre la barra de histograma amarilla hacia la izquierda para ambos canales. Utilice la vista de división a continuación para observar la señal de colocalización, que será visible en gris. Tenga en cuenta que, dado que las señales fluorescentes de las dos células no están realmente colocalizadas, el umbral deberá moverse hacia la izquierda para que comiencen a aparecer falsas colocalizaciones en los puntos de contacto célula-célula.
   6. Haga clic en Build Coloc Channel en el lado derecho para completar el proceso. Haga clic en la vista 3D para volver a la vista 3D estándar. Un canal de resultados de colocalización ahora será visible en gris y aparecerá en el cuadro de ajuste de la pantalla.
   7. Cree la superficie, las manchas cercanas a la superficie y el casco convexo del canal de resultados de colocalización utilizando los pasos descritos en 5.4-5.7 (Figura 3E, F).
   8. Registre el volumen del casco convexo. Este es el volumen de superposición de territorios. Divida este número por el volumen de territorio de uno de los astrocitos para calcular el porcentaje de superposición de territorio. Elija el control o astrocito de tipo salvaje si uno de los astrocitos está manipulado genéticamente con respecto al otro.

La Figura 1 presenta un esquema esquemático de los principales pasos y flujo de trabajo para este protocolo. La Figura 2 muestra capturas de pantalla de pasos clave utilizando el software de análisis de imágenes para generar una superficie, generar manchas cerca de la superficie y generar un casco convexo. La Figura 3 demuestra la aplicación de esta técnica para determinar la superposición/mosaico del territorio de los astrocitos. En la Figura 4, los resultados representativos de un manuscrito publicado previamente9 demuestran la aplicación de este protocolo. En la Figura 4A y la Figura 4B, el derribo de la molécula de adhesión celular enriquecida con astrocitos hepaCAM reduce significativamente el volumen del territorio de los astrocitos. En la Figura 4C y la Figura 4D, se utilizó el Análisis de Mosaico con Marcadores Dobles (MADM) para introducir el etiquetado de mosaico disperso y la modificación genética concurrente en la corteza del ratón. Con MADM, se generaron ratones donde los astrocitos de tipo salvaje expresan una proteína fluorescente roja (RFP) y los astrocitos knockout de Hepacam expresan una proteína fluorescente verde (GFP). Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se calculó el porcentaje de superposición de territorio entre los pares de astrocitos vecinos RFP y GFP (WT: KO). Como control, esto se comparó con los pares de astrocitos vecinos RFP y GFP en ratones sin modificación genética de Hepacam (WT: WT). Los pares de astrocitos WT:KO mostraron un porcentaje significativamente mayor de volumen de superposición de territorios en comparación con los pares de astrocitos WT:WT. En conjunto, estos resultados demuestran que hepaCAM es necesario para el volumen normal del territorio de astrocitos y el mosaico de astrocitos.

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo para analizar el volumen del territorio de astrocitos. (A) El protocolo requiere un ratón con marcado fluorescente escaso o mosaico de astrocitos. (B) El ratón es perfundido y luego el cerebro es resecado, procesado y congelado. (C) El cerebro congelado se secciona usando un criostato y (D) se recogen las secciones de tejido que flotan libremente. (E) Después de la sección, las secciones de tejido flotante se tiñen por inmunohistoquímica y luego (F) se montan en portaobjetos. (G) Los astrocitos dentro de las secciones de tejido montadas se toman imágenes mediante microscopía confocal. (H) Finalmente, los volúmenes de territorio de las células fotografiadas se cuantifican utilizando un software de análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos clave en el procedimiento de análisis de imágenes para el volumen del territorio de astrocitos. (A) Vista de la celda con región de interés cuadro que excluye otra señal en la imagen del procedimiento de análisis. (B) Un umbral relativo aceptable para la creación de superficie (gris) utilizando señal (rojo). (C) Superficie completada con celda principal seleccionada (amarillo). Otras partes de la superficie que no son la celda se eliminarán (rojo). (D) Superficie translúcida con manchas creadas. (E) Primer plano de la superficie translúcida con manchas creadas para mostrar una distribución aceptable de manchas en relación con la superficie. (F) Casco convexo final. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Pasos clave en el análisis de superposición de territorios de astrocitos. (A) Imagen representativa de dos astrocitos que expresan diferentes marcadores fluorescentes, GFP (verde) y RFP (magenta). (B) Generación de un casco convexo para cada astrocito. (C) Vista de canales GFP y RFP enmascarados, con canales originales eliminados. (D) Ejemplo de umbral utilizando la herramienta "Coloc" para crear un canal de "Resultado de colocalización". La señal "colocalizada" se muestra en gris. (E) Vista de los dos canales enmascarados. (F) Una vista rotada del casco convexo del canal "Resultado de colocalización" (gris) que representa el volumen de superposición del territorio. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aplicación exitosa del protocolo para medir el volumen del territorio de los astrocitos y la superposición del territorio de los astrocitos. (A) Astrocitos en la corteza visual de ratones CD1 de tipo salvaje en el día postnatal 21, expresando mCherry-CAAX (cian) y un shRNA de control (shScramble) o un shRNA dirigido a hepaCAM (shHepacam). El territorio de los astrocitos está delineado en rojo. (B) La pérdida de hepaCAM reduce significativamente el volumen del territorio de los astrocitos. Los puntos de datos representan promedios individuales del ratón. Las barras de error se ± s.e.m. Nested t-test. (C) Astrocitos vecinos en la corteza del ratón en el día postnatal 21 que expresan GFP (verde) o RFP (magenta). En ratones MADM9 WT:WT, ambos astrocitos son de tipo salvaje. En los ratones MADM9 WT:KO, el astrocito verde es de tipo salvaje y el astrocito magenta es nulo para Hepacam. El volumen de superposición de territorio se muestra en azul. (MADM9 WT:WT genotipo: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotipo: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). D) Cuantificación del porcentaje de superposición del volumen del territorio. Los puntos de datos representan promedios individuales del ratón. Las barras de error se ± s.e.m. Nested t-test. Barras de escala = 20 μm. Los paneles de esta figura se reimprimen de Baldwin et al9 con permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Los autores no tienen conflictos de intereses.