Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

Alex R. Eaker; Katherine T. Baldwin

doi:10.3791/63804

Artículo de método

Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre

DOI:

10.3791/63804

⸱

20 de abril de 2022

Alex R. Eaker¹ , Katherine T. Baldwin¹^,²

¹Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina, Chapel Hill

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe métodos para seccionar, teñir e obtener imágenes de secciones de tejido flotantes del cerebro del ratón, seguidos de una descripción detallada del análisis del volumen del territorio de los astrocitos y la superposición o mosaico del territorio de los astrocitos.

Resumen

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Los astrocitos poseen un asombroso grado de complejidad morfológica que les permite interactuar con casi todos los tipos de células y estructuras dentro del cerebro. A través de estas interacciones, los astrocitos regulan activamente muchas funciones cerebrales críticas, incluida la formación de sinapsis, la neurotransmisión y la homeostasis iónica. En el cerebro de los roedores, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad durante las primeras tres semanas postnatales y establecen territorios distintos y no superpuestos para alicatar el cerebro. Este protocolo proporciona un método establecido para analizar el volumen del territorio de los astrocitos y el mosaico de astrocitos utilizando secciones de tejido que flotan libremente del cerebro del ratón. En primer lugar, este protocolo describe los pasos para la recolección de tejidos, la criosecciona y la inmunotinción de secciones de tejido que flotan libremente. En segundo lugar, este protocolo describe la adquisición de imágenes y el análisis del volumen del territorio de los astrocitos y el volumen de superposición del territorio, utilizando el software de análisis de imágenes disponible comercialmente. Por último, este manuscrito discute las ventajas, consideraciones importantes, trampas comunes y limitaciones de estos métodos. Este protocolo requiere tejido cerebral con marcado fluorescente escaso o mosaico de astrocitos, y está diseñado para ser utilizado con equipos de laboratorio comunes, microscopía confocal y software de análisis de imágenes disponible comercialmente.

Introducción

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Los astrocitos son células elaboradamente ramificadas que realizan muchas funciones importantes en el cerebro¹. En la corteza del ratón, las células madre gliales radiales dan lugar a astrocitos durante las etapas embrionaria tardía y postnatal temprana². Durante las tres primeras semanas postnatales, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad, desarrollando miles de ramas finas que interactúan directamente con las sinapsis¹. Al mismo tiempo, los astrocitos interactúan con los astrocitos vecinos para establecer territorios discretos y no superpuestos para alicatar el cerebro^3<....

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Protocolo

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Todos los ratones se utilizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y la División de Medicina Comparada (número de protocolo IACUC 21-116.0). Se utilizaron ratones de ambos sexos en el día postnatal 21 (P21) para estos experimentos. Los ratones CD1 se obtuvieron comercialmente (Tabla de Materiales), y los ratones MADM9 WT:WT y MADM9 WT:KO fueron descritos previamente⁹.

NOTA: Este protocolo requiere cerebros con expresión de proteínas fluorescentes en una población escasa de astrocitos. La expresión de prote....

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Resultados

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La Figura 1 presenta un esquema esquemático de los principales pasos y flujo de trabajo para este protocolo. La Figura 2 muestra capturas de pantalla de pasos clave utilizando el software de análisis de imágenes para generar una superficie, generar manchas cerca de la superficie y generar un casco convexo. La Figura 3 demuestra la aplicación de esta técnica para determinar la superposición/mosaico del territorio de los astrocitos. E.......

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Discusión

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Este protocolo describe un método establecido para analizar el volumen del territorio de astrocitos y el mosaico de astrocitos en la corteza del ratón, detallando todos los pasos principales que comienzan con la perfusión y terminan con el análisis de imágenes. Este protocolo requiere cerebros de ratones que expresan proteínas fluorescentes en una población escasa o en mosaico de astrocitos. Fuera de este requisito, se pueden usar ratones de cualquier edad para este protocolo, con solo ajustes menores en la configuración.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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La microscopía se realizó en el NÚCLEO de Microscopía de Neurociencia de la UNC (RRID: SCR_019060), apoyado en parte por la subvención de apoyo del Centro de Neurociencia NIH-NINDS P30 NS045892 y la subvención de apoyo del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo NIH-NICHD U54 HD079124. La Figura 1 se creó con BioRender.com. Las imágenes y los datos de la Figura 4 se reimprimen de una publicación anterior⁹ con permiso del editor.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#5 pinzas	Roboz	RS-5045
1 mL TB Jeringa	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (solución salina tamponada tris)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl a pH 7.4, dH₂O a 1 L; almacenar a temperatura ambiente (RT)
Placa de 12 pocillos	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH₂O; almacenar en RT
1x TBS + Heparina			28.2 mg Heparina + 250 mL 1x TBS; almacenar en 4 & grados; C
Placa de 24 pocillos	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sacarosa en TBS			15 g de sacarosa, 1x TBS a 50 mL; almacenar a 4 & grados; C
4% de PFA (paraformaldehído) en TBS			PFA, 4-6 gránulos de NaOH, 100 mL 10x TBS, dH₂O a 1 L; almacenar a 4 & grados; C
Avertin			0,3125 g de tri-bromoetanol, 0,625 mL de metilbutanol, dH₂O a 25 mL; almacenar a 4 & grados; C; desechar 2 semanas después de hacer
el bloqueo y tampón			10% suero de cabra en TBST; almacenar a 4 & grados; C
Ratones CD1	Charles River	022
Frasco de colección para cerebros	Fisher Scientific	03-337-20
Software de adquisición confocal	Olympus	FV31S-SW
Microscopio confocal	Olympus	FV3000RS
Cubreobjetos	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cuchilla de criostato	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Molde de incrustación	Polysciences	18646A-1
Medio de congelación			2:1 30% sacarosa:OCT; almacenar en RT
GFP anticuerpo	Aves Labs	GFP1010
Glicerol	Thermo Scientific	158920010
Cabra anti-pollo 488	Invitrogen	A-11039
Cabra anti-conejo 594	Invitrogen	A11037
Suero de cabra	Gibco	16210064
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Versión 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A Lata
almuerzo de metal	AQUARIUS	N/A	de Amazon, "DIY Large Fun Box"
Metilbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Tijeras de Disección	Roboz	RS-5921
Medio de montaje			20 mM Tris pH 8.0, 90% glicerol, 0.5% N-galato de propilo; tienda a 4 ° C; Hasta 2 meses
Esmalte de uñas	VWR	100491-940
N-galato de propilo	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Aceite	Olympus	IMMOIL-F30CC	Específico para microscopio/objetivo
Tijeras de operación 6"	Roboz	RS-6820
Agitador de plataforma orbital	Fisher Scientific 88861043		Velocidad mínima necesaria: 25 rpm
Pincel	Bogrinuo	N/A	de Amazon, "Pinceles de Detalle - Pinceles en miniatura"
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Pipeta Pasteur (5.75")	VWR	14672-608
Pipeta Pasteur (9")	VWR	14672-380
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Hoja de afeitar	Fisher Scientific	12-640
RFP anticuerpo	Rockland	600-401-379
Medio			1:1 glicerol:1x TBS; almacenar en RT
Slides	VWR	48311-703
Criloide de sodio	Fisher Scientific	BP358-212
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S5881
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton en 1x TBS; almacenar en RT
Pipeta de transferencia	VWR	414004-002
Tri-bromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hidroximetil)aminometano	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 ( de alta calidad)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension proporcionar como material complementario

40 g de de anticuerpos de de seccionamiento

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).

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Mosaico de astrocitos solapamiento de territorios secciones flotantes microscop a confocal protocolo de inmunotinci n software de an lisis de im genes morfolog a de los astrocitos manipulaci n gen tica an lisis de casco convexo

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