Imágenes de superresolución sin etiquetas habilitadas por imágenes vibracionales de tejido hinchado y análisis

Resumen

Al combinar la química de hidrogel de expansión de muestras con microscopía de dispersión Raman estimulada química específica sin marcadores, el protocolo describe cómo lograr imágenes volumétricas de superresolución sin etiquetas en muestras biológicas. Con un algoritmo adicional de segmentación de imágenes de aprendizaje automático, se obtuvieron imágenes multicomponentes específicas de proteínas en tejidos sin marcaje de anticuerpos.

Resumen

La utilización universal de la microscopía de fluorescencia, especialmente la microscopía de superresolución, ha hecho avanzar enormemente el conocimiento sobre la biología moderna. Por el contrario, el requisito de etiquetado de fluoróforos en técnicas fluorescentes plantea desafíos significativos, como el fotoblanqueo y el etiquetado no uniforme de las sondas fluorescentes y el procesamiento prolongado de las muestras. En este protocolo, se presentan los procedimientos de trabajo detallados de la imagen vibracional de tejido inflamado y el análisis (VISTA). VISTA evita los obstáculos asociados con los fluoróforos y logra imágenes volumétricas de superresolución sin etiquetas en muestras biológicas con una resolución espacial de hasta 78 nm. El procedimiento se establece mediante la inclusión de células y tejidos en hidrogel, la expansión isotrópica del híbrido de muestra de hidrogel y la visualización de las distribuciones de proteínas endógenas mediante imágenes vibracionales con microscopía de dispersión Raman estimulada. El método se demuestra tanto en células como en tejidos cerebrales de ratón. Se observaron imágenes de VISTA e inmunofluorescencia altamente correlativas, lo que validó el origen proteico de las especificidades de las imágenes. Aprovechando dicha correlación, se entrenó un algoritmo de segmentación de imágenes basado en el aprendizaje automático para lograr la predicción de múltiples componentes de núcleos, vasos sanguíneos, células neuronales y dendritas a partir de imágenes de cerebro de ratón sin etiquetas. El procedimiento se adaptó aún más para investigar los agregados patológicos de poliglutamina (polyQ) en las células y las placas de beta amiloide (Aβ) en los tejidos cerebrales con alto rendimiento, lo que justifica su potencial para muestras clínicas a gran escala.

Introducción

El desarrollo de los métodos de imagen óptica ha revolucionado la comprensión de la biología moderna porque proporcionan información espacial y temporal sin precedentes de objetivos a diferentes escalas, desde proteínas subcelulares hasta órganos^completos. Entre ellos, la microscopía de fluorescencia es la más consolidada, con una amplia paleta de colorantes orgánicos con altos coeficientes de extinción y rendimientos cuánticos², proteínas fluorescentes codificadas genéticamente fáciles de usar³ y métodos de superresolución como STED, Palm y STORM para obtener imá....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Tecnología de California, y los procedimientos del protocolo cumplieron con todas las regulaciones éticas relevantes.

1. Preparación de soluciones madre para la fijación y expansión de la muestra

1. Prepare 40 mL de solución de fijación disolviendo primero 12 g de acrilamida (30% p/v) sólido en 26 mL de agua libre de nucleasas. A continuación, añada 10 ml de solución madre de PFA al 16% a la mezcla. Por último, añadir 4 ....

Resultados

Después de establecer el principio de funcionamiento del método de imagen y análisis, se realizó el registro de imágenes para evaluar la relación de expansión y garantizar la expansión isotrópica durante el procesamiento de la muestra (Figura 1A, B). Se tomaron imágenes tanto de muestras no tratadas como de VISTA, dirigiéndose a la vibración del enlace a 2940 ^cm-1, que se origina en CH₃ de proteínas endógenas. En las muestras no tratadas, las estructura.......

Discusión

En resumen, presentamos el protocolo para VISTA, que es una modalidad libre de etiquetas para obtener imágenes de estructuras celulares y subcelulares ricas en proteínas de células y tejidos. Al dirigirse al CH₃ endógeno de las proteínas en células y tejidos incrustados en hidrogel, el método logra una resolución de imagen efectiva de hasta 78 nm en muestras biológicas y resuelve la extrusión menor en agregados de huntingtina y fibrillas en placas de Aβ. Esta técnica es la pri.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehído	Microscopía electrónica ciencia	15710	diluido al 4% en
PBS 25x objetivo de inmersión en agua	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Ratones	mutantes Centros de recursos e investigación y el Laboratorio Jackson	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Cerebro de Alzheimer
Objetivo de inmersión en agua 60x	Olympus		UPLSAPO60XWIR NA 1.2
Acrilamida	Sigma-Aldrich	A9099
persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Tecnología de señalización celular	8707
anti-NeuN	Tecnología de señalización celular	24307
cubreobjetos de borosilicato #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Ratones	Jackson Laboratory (JAX)	664	Ratones normales
D2O	Sigma-Aldrich	151882	para calibración SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
corredera de vidrio 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
cabra anti-pollo IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
cabra anti-ratón IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
cabra anti-conejo IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
cabra anti-ratas IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Aisladores de silicona Press-To-Seal	Sigma-Aldrich	GBL664108	espaciador de microscopio
Htt-97Q-GFP	Regalo del Prof. R. Kopito y el Prof. F.-U.Hartl.
Microscopio láser de barrido	Olympus	FV3000	microscopio confocal de barrido láser
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	agente de transfección
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (lectina)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Espaciador de microscopio	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-metilenebisacrilamida (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	comprado como solución al 2% en agua
Agua libre de nucleasa	Thermo Fisher	10977-015
Penicilina-Estreptomicina	GIBCO	15140-122
perlas de poliestireno	Sigma-Aldrich	43302	para la caracterización de la resolución
Acrilato de sodio	Sigma-Aldrich	408220
dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	71725
pincel de lana suave #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps ancho de pulso
tetrametiletilendiamina	Sigma-Aldrich	T9281
Matraz de cultivo de tejidos 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Pinza Sigma-Aldrich	P9416
	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotomo	Leica	VT1200S	el vibratomo