Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

Tanner Rathbone; Ilayda Ates; Callie Stuart; Tina Parker; Renee N. Cottle

doi:10.3791/63828

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Artículo de método

Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

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DOI:

10.3791/63828

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2 de junio de 2022

Tanner Rathbone^*¹ , Ilayda Ates^*¹ , Callie Stuart¹ , Tina Parker² , Renee N. Cottle¹

¹Department of Bioengineering, Clemson University, ²Godley Snell Research Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.

Resumen

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para aislar los hepatocitos primarios de ratón seguido de la administración mediada por electroporación de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) y ARNm. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando un método de perfusión retrógrada de tres pasos, lo que resultó en altos rendimientos de hasta 50 × 10⁶ células por hígado y una viabilidad celular de >85%. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para el recubrimiento, tinción y cultivo de hepatocitos. Los resultados indican que la electroporación proporciona una alta eficiencia de transfección del 89%, medida por el porcentaje de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) y una viabilidad celular modesta de >35% en hepatocitos de ratón.

Para demostrar la utilidad de este enfoque, CRISPR-Cas9 dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se electroporó en hepatocitos primarios de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen terapéutico relacionado con una enfermedad metabólica hereditaria (IMD) del hígado. Se observó una mayor edición en el objetivo del 78% para los RNP en comparación con la eficiencia de edición del 47% con ARNm. La funcionalidad de los hepatocitos se evaluó in vitro mediante un ensayo de albúmina que indicó que la administración de CRISPR-Cas9 como RNPs y ARNm da como resultado una viabilidad celular comparable en hepatocitos primarios de ratón. Una aplicación prometedora para este protocolo es la generación de modelos de ratón para enfermedades genéticas humanas que afectan al hígado.

Introducción

Los IMD del hígado son trastornos genéticos caracterizados por la deficiencia de una enzima hepática crucial involucrada en el metabolismo que conduce a la acumulación de metabolitos tóxicos. Sin tratamiento, las IMD del hígado resultan en insuficiencia orgánica o muerte prematura ^1,2. La única opción curativa para los pacientes con IMD del hígado es el trasplante hepático ortotópico, que es limitado debido a la baja disponibilidad de órganos de donantes y las complicaciones de la terapia inmunosupresora después del procedimiento ^3,4. Según datos recie....