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Artículo de método

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

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DOI:

10.3791/63834

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1 de abril de 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Resumen

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. Estos cambios morfológicos se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Aquí, se proporcionan dos ejemplos de contextos fisiológicamente relevantes en los que estudiar la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: procesos faciales de ratón, en particular procesos maxilares E11.5, y células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de estantes palatinos secundarios E13.5. Para superar la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de fosfoproteínas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las fosfoproteínas después de la eliminación occidental de lisados de proteínas de células enteras. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial.

Introducción

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para generar el labio superior. Al mismo tiempo, la palatogénesis se inicia con la formación de distintas excrecencias, los estantes palatinos secundarios, desde el lado oral de los procesos maxilares en E11.5. Con el tiempo, los estantes palatinos crecen hacia abajo a ambos lados de la lengua, se elevan a una posición opuesta por encima de la lengua y, finalmente, se fusionan en la línea media para formar un paladar continuo que separa las cavidades nasales y orales por E16.51.

Estos cambios morfológicos a lo largo del desarrollo craneofacial se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Por ejemplo, los receptores de la membrana celular, como las subfamilias de receptores β del factor de crecimiento transformador (TGF), incluidos los receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR) y varias familias de receptores tirosina quinasa (RTK), se autofosforilan al unirse y activarse en las células de la cresta neural craneal 2,3,4 . Además, el receptor transmembrana acoplado a la proteína G Smoothened se fosforila en las células de la cresta neural craneal y el ectodermo craneofacial aguas abajo del ligando Sonic Hedgehog (SHH) que se une al receptor Patched1, lo que resulta en una acumulación suavizada en la membrana ciliar y la activación de la vía SHH5. Tales interacciones ligando-receptor pueden ocurrir a través de la señalización autocrina, paracrina y / o yuxtacrina en contextos craneofaciales. Por ejemplo, se sabe que BMP6 señala de manera autocrina durante la diferenciación de condrocitos6, mientras que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 8 se expresa en el ectodermo del arco faríngeo y se une a los miembros de la familia FGF de RTK expresados en el mesénquima del arco faríngeo de manera paracrina para iniciar el modelado y el crecimiento de los arcos faríngeos7, 8,9,10. Además, la señalización de Notch se activa tanto en condrocitos como en osteoblastos durante el desarrollo esquelético craneofacial a través de la señalización de yuxtacrina cuando los ligandos Transmembrana Delta y/o Jagged se unen a los receptores de Notch transmembrana en las células vecinas, que posteriormente se escindieron y fosforilan11. Sin embargo, hay otros pares de ligandos y receptores importantes para el desarrollo craneofacial que tienen la flexibilidad para funcionar tanto en la señalización autocrina como en la paracrina. Como ejemplo, durante la morfogénesis de los dientes murinos, se ha demostrado que el ligando del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA indica de manera autocrina para activar el RTK PDGFRα en el epitelio12 del órgano del esmalte. Por el contrario, en los procesos faciales murinos durante la mitad de la gestación, las transcripciones que codifican los ligandos PDGF-AA y PDGF-CC se expresan en el ectodermo craneofacial, mientras que el receptor PDGFRα se expresa en el mesénquima subyacente derivado de la cresta neural craneal, lo que resulta en una señalización paracrina 13,14,15,16,17 . Independientemente del mecanismo de señalización, estos eventos de fosforilación del receptor a menudo resultan en el reclutamiento de proteínas adaptadoras y / o moléculas de señalización, que con frecuencia se fosforilan para iniciar cascadas de quinasa intracelular, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)18,19.

Los efectores intracelulares terminales de estas cascadas pueden fosforilar una serie de sustratos, como factores de transcripción, unión a ARN, proteínas citoesqueléticas y de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 y Sox9 26 se encuentran entre los factores de transcripción fosforilados en el contexto del desarrollo craneofacial. Esta modificación post-traduccional (PTM) puede afectar directamente la susceptibilidad a ptM alternativos, dimerización, estabilidad, escisión y/o afinidad de unión al ADN, entre otras actividades 20,21,25,26. Además, la proteína de unión al ARN Srsf3 se fosforila en el contexto del desarrollo craneofacial, lo que lleva a su translocación nuclear27. En general, se ha demostrado que la fosforilación de las proteínas de unión al ARN afecta su localización subcelular, las interacciones proteína-proteína, la unión al ARN y/o la especificidad de la secuencia28. Además, la fosforilación de la actomiosina puede conducir a reordenamientos citoesqueléticos a lo largo del desarrollo craneofacial29,30, y la fosforilación de proteínas de la matriz extracelular, como las pequeñas glicoproteínas ligadas al ligando a la ligando a integrinas N, contribuye a la biomineralización durante el desarrollo esquelético31. A través de lo anterior y muchos otros ejemplos, es evidente que hay amplias implicaciones para la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial. Añadiendo un nivel adicional de regulación, la fosforilación de proteínas es modulada aún más por las fosfatasas, que contrarrestan las quinasas mediante la eliminación de grupos fosfato.

Estos eventos de fosforilación tanto a nivel de molécula receptora como efectora son críticos para la propagación de las vías de señalización y, en última instancia, dan lugar a cambios en la expresión génica en el núcleo, impulsando actividades celulares específicas, como la migración, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación, que resultan en la formación adecuada de la cara del mamífero. Dada la especificidad del contexto de las interacciones de las proteínas con las quinasas y las fosfatasas, los cambios resultantes en los PTM y sus efectos sobre la actividad celular, es fundamental que estos parámetros se estudien en un entorno fisiológicamente relevante para obtener una comprensión completa de la contribución de los eventos de fosforilación al desarrollo craneofacial. Aquí, se proporcionan ejemplos de dos contextos en los que estudiar la fosforilación de proteínas y, por lo tanto, la activación de las vías de señalización durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: los procesos faciales de ratón, en particular los procesos maxilares E11.5, y las células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de E13.5 estantes palatinos secundarios, tanto primarios32 como inmortalizados33 . En E11.5, los procesos maxilares están en proceso de fusión con los procesos nasales laterales y mediales1, lo que representa un punto de tiempo crítico durante el desarrollo craneofacial del ratón. Además, los procesos maxilares y las células derivadas de los estantes palatinos se eligieron aquí porque las últimas estructuras son derivadas de las primeras, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de interrogar la fosforilación de proteínas in vivo e in vitro en contextos relacionados. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a procesos faciales alternativos y puntos de tiempo de desarrollo.

Un problema crítico en el estudio de las proteínas fosforiladas es que son fácilmente desfosforiladas durante el aislamiento de proteínas por abundantes fosfatasas ambientales. Para superar esta barrera, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de proteínas fosforiladas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las proteínas fosforiladas. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias vías de señalización activas durante el desarrollo craneofacial.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado y se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones institucionales. Se utilizaron ratones hembra 129S4 a los 1,5-6 meses de edad y alojados a una temperatura subteronetral de 21-23 °C para la recolección de embriones. Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se representa en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software, reactivos y animales utilizados en este protocolo.

1. Recolección de embriones de ratón E11.5

  1. Eutanasiar a la ratón hembra embarazada 11,5 días después de la detección del tapón vaginal durante el apareamiento cronometrado en una cámara de CO2 utilizando el caudal de CO2 aprobado por la IACUC requerido para aproximadamente el 50% de desplazamiento (2,95 L /min en una cámara de 360 en3 ) y la duración de la exposición (ver Tabla de Materiales). Realizar luxación cervical como método secundario de eutanasia. Proceda inmediatamente a la disección.
  2. Coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección con el lado ventral hacia arriba. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%.
  3. Abra la cavidad abdominal pellizcando y levantando la piel anterior a la abertura vaginal con pinzas Semken rectas y cortando la piel levantada y las capas subyacentes con tijeras quirúrgicas de cuchilla recta en un ángulo de 45 ° a cada lado para generar una forma de "V" que se extiende a cada superficie lateral aproximadamente a la mitad entre las extremidades anteriores y las extremidades posteriores.
  4. Usando las pinzas Semken, agarre uno de los cuernos uterinos y corte debajo del oviducto y por encima del cuello uterino con las tijeras quirúrgicas. Corte el mesometrio para permitir la extirpación completa del cuerno uterino.
  5. Transfiera el cuerno uterino diseccionado a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato histológico (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 monobásico, 10.14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] en una placa de Petri de 10 cm.
  6. Retire el segundo cuerno uterino en el lado opuesto de la cavidad abdominal utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 1.4-1.5.
  7. Coloque la placa de Petri de 10 cm que contiene ambos cuernos uterinos en hielo si no procede inmediatamente a la disección de embriones individuales (es decir, si se diseccionará un segundo ratón hembra).
  8. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, diseccione cuidadosamente cada embrión de los cuernos uterinos con fórceps finos Dumont #5. Retire lentamente el miometrio, la decidua y el corion. Desgarra y elimina el amnios relativamente transparente que rodea al embrión, y corta el cordón umbilical que conecta el embrión con la placenta.
  9. Transfiera cada embrión diseccionado a 2,5 ml de PBS histológico en un pozo individual de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado o una cuchara de embrión.
    NOTA: Si trabaja con una camada que puede contener embriones de más de un genotipo, guarde el amnios que rodea a cada embrión para el genotipado colocando cada uno en su propio tubo de microcentrífuga preetiquetado de 0,5 ml en hielo.

2. Disección de procesos maxilares de embriones de ratón E11.5

  1. Preparar tres placas de Petri de 10 cm que contengan 10 mL de PBS histológico y mantenerlas en hielo para ser utilizadas en rotación entre embriones.
  2. Transfiera un embrión de un pozo individual de la placa de cultivo celular de 12 pocillos a una de las placas de Petri de 10 cm con PBS histológico en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado o una cuchara de embrión.
  3. Bajo el microscopio de disección, separe cada proceso maxilar de la cara usando las pinzas finas. Primero, corte el lado anterior de un proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso nasal lateral y el proceso maxilar (Figura 2A).
  4. En segundo lugar, cortar el lado posterior del proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso maxilar y el proceso mandibular (Figura 2A).
  5. En tercer lugar, para separar completamente el proceso maxilar, haga un corte vertical de los lados anterior a posterior del proceso maxilar en el lado ocular del proceso maxilar donde terminan las hendiduras naturales a las que se hace referencia anteriormente (Figura 2A-C).
  6. Repita estos tres cortes para el proceso maxilar en el lado opuesto de la cara.
  7. Usando una pipeta Pasteur de 9" con un bulbo de látex pequeño de 2 ml, transfiera el par diseccionado de procesos maxilares y una pequeña gota de aproximadamente 30 μL de PBS histológico a una placa de Petri de 35 mm etiquetada sobre hielo (Figura 2D).
  8. Siga los pasos 2.3-2.7 para cada embrión, rotando las tres placas de Petri de 10 cm que contienen HISTOLOGÍA PBS en hielo entre embriones. Coloque pares individuales de procesos maxilares disecados en placas de Petri separadas de 35 mm sobre hielo.
    NOTA: La separación del ectodermo y el mesénquima del proceso maxilar (pasos 2.9-2.17) se puede realizar después de diseccionar los procesos maxilares de todos los embriones en la camada. Si se desean procesos maxilares intactos que contengan tanto el ectodermo como el mesénquima, continúe con el paso 2.18 a continuación.
  9. Preparar 250 μL de tripsina fresca al 2% en pbS de cultivo tisular y 250 μL de suero bovino fetal (FBS) al 10% en cultivo tisular PBS y almacenar en hielo.
  10. Coloque una segunda gota pequeña de aproximadamente 30 μL de tripsina al 2% en la placa de Petri de 35 mm separada de la primera gota pequeña de PBS histológico que contiene los procesos maxilares. Transfiera el par de procesos maxilares a la pequeña gota de tripsina al 2% utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).
  11. Incubar el plato en hielo durante 15 min.
  12. Retire la placa de Petri de 35 mm del hielo y colóquela debajo del microscopio de disección.
  13. Usando las pinzas finas, lenta y cuidadosamente saque la capa de ectodermo de cada proceso maxilar (Figura 2E).
    NOTA: Si el ectodermo no se está separando del mesénquima en una lámina intacta, incube en tripsina al 2% a temperatura ambiente (RT) durante un máximo de 5 minutos adicionales antes de continuar con la separación. Si el tejido comienza a desintegrarse en el 2% de tripsina, mueva los procesos maxilares al 10% de FBS como se describe a continuación para neutralizar la tripsina y terminar la separación del ectodermo y el mesénquima.
  14. Una vez que el ectodermo del proceso maxilar y el mesénquima están separados (Figura 2F), transfiera los tejidos deseados del par de procesos maxilares a una tercera gota pequeña de aproximadamente 30 μL de 10% FBS, separada de las dos gotas pequeñas anteriores, utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).
  15. Coloque la placa de Petri de 35 mm sobre hielo para detener la tripsinización.
  16. Incubar los tejidos del proceso maxilar en hielo en 10% FBS durante 1-2 min, y luego transferir los tejidos de ambos procesos maxilares a una cuarta gota pequeña de aproximadamente 30 μL de PBS histológico prechillado en hielo, separada de las tres gotas pequeñas anteriores, utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).
  17. Incubar los tejidos del proceso maxilar en histología PBS durante 1 min mientras se arremolina suavemente el PBS histológico alrededor de los tejidos del proceso maxilar con la punta de la pipeta Pasteur para garantizar que todo fbS se enjuague del tejido.
  18. Transfiera el par de tejidos de proceso maxilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado en hielo utilizando la pipeta Pasteur, minimizando la transferencia de PBS histológico. Retire cualquier exceso de PBS histológico en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con la pipeta Pasteur.
  19. Siga los pasos anteriores para diseccionar los procesos maxilares de cada embrión en la camada.
  20. Procese las muestras inmediatamente para aislar lisados de proteínas de células enteras (abajo) o almacenar a -80 °C a largo plazo. Antes del almacenamiento a largo plazo, congele el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un baño de 100% EtOH sobre hielo seco durante 5 minutos.

3. Aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos maxilares de ratón

  1. Si los procesos maxilares se congelaron previamente a -80 °C, descongelarlos en hielo.
  2. Añadir 0,1 ml de tampón de lisis NP-40 helado (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40, 2 mM de EDTA; almacenado a 4 °C) con inhibidores de proteasa y fosfatasa (1x cóctel completo de mini inhibidor de la proteasa [disuelto en agua; almacenado a -20 °C], 1 mM PMSF [disuelto en isopropanol; almacenado a 4 °C], 10 mM NaF [almacenado a -20 °C; evitar la congelación/descongelación], 1 mM Na3VO4 [almacenado a -20 °C], 25 mM β-glicerofosfato [almacenado a 4 °C]) añadido inmediatamente antes de su uso en hielo.
    NOTA: El fraccionamiento celular se puede realizar alternativamente para aislar fracciones de proteínas citoplasmáticas, nucleares, de membrana o mitocondriales.
  3. Pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un pipetman de 200 μL.
  4. Vórtice durante 10 s, y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un pipetman de 200 μL. Evita generar burbujas.
  5. Incubar a 4 °C durante 2 h mientras gira de extremo a extremo utilizando una paleta de 1,5 mL/2 mL con un revólver de tubo.
  6. Centrifugar las muestras a 13.500 × g durante 20 min a 4 °C.
  7. Recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo con un tubo de 200 ml.
  8. Cuantificar la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas, utilizando 10 μL de lisado proteico + 10 μL de tampón de lisis NP-40 para muestras experimentales y 3-5 diluciones de albúmina sérica bovina (fracción V) (BSA) en tampón de lisis NP-40 en un rango de 0.25-2.0 mg / ml como estándares de proteínas.
  9. Proceda con la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) (paso 5) o congele rápidamente los lisados restantes en hielo seco y guárdelo a -80 °C a largo plazo.

4. Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de células primarias y/o inmortalizadas de células de mesén palatino embrionario de ratón (MEPM)

NOTA: El aislamiento y cultivo de células MEPM primarias de embriones de ratón E13.5 y células MEPM inmortalizadas se han descrito previamente 32,33,34. La estimulación de las células con factor de crecimiento (pasos 4.1-4.7) se puede realizar antes de la lisis celular. Si se desean células no estimuladas, continúe con el paso 4.8 a continuación.

  1. Aspire el medio de crecimiento [medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 10% FBS] de las células MEPM a ~70% de confluencia en un plato de cultivo celular de 6 cm utilizando una pipeta Pasteur de 5,75" unida a un sistema de vacío.
  2. Lavar las células con 1 ml de PBS de cultivo de tejidos.
  3. Añadir 3 ml de medio de inanición sérica [DMEM con 50 U/mL de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,1% FBS] precalentado en un baño de agua a 37 °C.
  4. Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 23 h.
  5. Reemplace el medio de inanición sérica con 3 ml de medio de inanición sérica fresco y precalentado.
  6. Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 1 h.
  7. Estimular las células con el factor de crecimiento de elección a una concentración determinada empíricamente durante el período de tiempo deseado.
  8. Aspire el medio desde las celdas MEPM a una confluencia del 80%-100% utilizando una pipeta Pasteur de 5.75" unida a un sistema de vacío.
  9. Lavar las células dos veces con PBS de cultivo de tejido helado (1 ml para una placa de cultivo celular de 6 cm); incline la placa hacia un lado durante el último lavado para asegurarse de que todo el PBS de cultivo de tejidos esté aspirado.
  10. Lisar las células agregando tampón de lisis NP-40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de su uso (0,1 ml para un plato de cultivo celular de 6 cm) en hielo.
  11. Incubar la placa en hielo durante 5 min con rotación aproximadamente cada min para asegurar una cobertura completa de la placa.
  12. Raspe las células de la placa usando un elevador de células preenfriado y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml preenfriado en hielo.
  13. Incubar la suspensión celular a 4 °C durante 30 min mientras gira de extremo a extremo utilizando una paleta de 1,5 mL/2 mL con un revólver de tubo.
  14. Continúe con los pasos 3.6-3.9 descritos anteriormente.

5. Western blotting de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y/o células MEPM para fosfoproteínas

  1. Prepare muestras de lisado de proteínas de células enteras para SDS-PAGE.
    1. Determinar la cantidad de proteína a cargar, dependiendo de la abundancia de proteínas en el tejido/célula; 12,5 μg suele ser suficiente para proteínas expresadas de forma robusta en lisados de proteínas de células enteras.
    2. Agregue un volumen igual de 2 tampón Laemmli [20% glicerol, 4% SDS, 0.004% azul de bromofenol, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] con 10% de β-mercaptoetanol agregado inmediatamente antes de su uso.
      PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es corrosivo para la piel o los ojos, tóxico, peligroso si se ingiere y tiene toxicidad acuática. Maneje usando guantes, una bata de laboratorio, protector facial y gafas de seguridad en una capucha de humo químico. Deseche de acuerdo con las pautas de salud y seguridad ambiental.
    3. Mezclar por vórtice.
    4. Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min en un mini baño seco.
    5. Mezclar por vórtice y colocar las muestras sobre hielo.
    6. Centrifugar a 9.400 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Coloque las muestras brevemente en hielo antes de cargarlas en el gel SDS-PAGE, o guárdelas a -20 °C a largo plazo.
  2. Realice SDS-PAGE utilizando una celda de electroforesis con un gel de proteína prefabricada al 4%-15% y un tampón de electroforesis35.
  3. Electrotransferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando tampón de transferencia con metanol al 0%-20% (0%-10% para proteínas mayores de 100 kDa; 20% para proteínas menores de 100 kDa) añadido inmediatamente antes de su uso35.
  4. Bloquee la membrana y sondee la fosfoproteína de interés.
    1. Después de la transferencia, lave la membrana en 1x solución salina tamponada tris (TBS) [20 mM Tris, 0.137 M NaCl, pH 7.6] durante 5 min en una caja de western blot.
    2. Incubar la membrana en 5 mL de tampón de bloqueo [1x TBS, 0.1% Tween 20, 5% p/v BSA; mezclado bien y filtrado a través de un filtro de jeringa de 25 mm con poros de 0.2 μm usando una jeringa de 10 mL con punta de luer] durante 1 h en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
      NOTA: No use leche como agente bloqueador al caracterizar fosfoproteínas, ya que contiene la fosfoproteína caseína, que puede causar una señal de fondo alta e inespecífica.
    3. Lave la membrana tres veces durante 5 min cada una en TBS-T [1x TBS, 0.1% Tween 20] en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
    4. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche en un tubo cónico de 50 ml utilizando una paleta de 50 ml con un revólver de tubo.
      NOTA: Consulte la hoja de datos de anticuerpos para conocer la concentración adecuada para el western blotting.
    5. Lave la membrana tres veces en RT durante 5 min cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
    6. Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado diluido en tampón de bloqueo durante 1 h en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
    7. Lave la membrana tres veces durante 5 minutos cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
    8. Incubar la membrana en sustrato de goteo occidental de quimioluminiscencia mejorada (ECL) [mezclando volúmenes iguales de las botellas 1 y 2; 0,5 ml de cada una para membranas grandes (8,6 cm x 6,7 cm)] durante 1 minuto, asegurando que toda la membrana esté continuamente expuesta al sustrato de goteo occidental de ECL.
    9. Drene la membrana del sustrato de goteo occidental ECL en exceso y desarrolle inmediatamente utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia.
  5. Despoje la membrana y repruebe la proteína total de interés.
    1. Coloque la membrana de PVDF en una bolsa transparente con revestimiento de polietileno que contenga 5 ml de tampón de extracción [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] con 8 μL/ml de β-mercaptoetanol añadido inmediatamente antes de su uso.
    2. Incubar a 50 °C durante 30 min con mecedora en horno de hibridación a 11 revoluciones por minuto.
    3. Lave la membrana tres veces en RT durante 5 min cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.
    4. Continúe con los pasos 5.4.2-5.4.9 descritos anteriormente.
  6. Cuantificar densidades de banda western blot utilizando el software ImageJ, normalizando los niveles de la proteína fosforilada de interés a los niveles de la proteína total de interés36.

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Resultados

Al intentar caracterizar la fosforilación de proteínas aisladas de procesos faciales de ratón y/o células mesenquimas palatales cultivadas, los resultados representativos idealmente revelarán una banda distinta y reproducible después de Western Blotting con un anticuerpo antifosfoproteína que corre a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente (Figura 3 ). Sin embargo, si se produce una fosforilación extensa de la proteína, puede haber un ligero desplazamient...

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Discusión

El protocolo descrito aquí permite a los investigadores sondear eventos críticos de señalización dependientes de la fosforilación durante el desarrollo craneofacial de una manera robusta y reproducible. Hay varios pasos críticos en este protocolo que aseguran la recopilación adecuada de datos y el análisis de los resultados. Ya sea aislando fosfoproteínas de procesos faciales de ratón y / o células mesenquimas palatales cultivadas, es imperativo moverse de manera rápida y eficiente mientras se mantienen todos los reactiv...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los ratones 129S4 fueron un regalo del Dr. Philippe Soriano, de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Este trabajo fue apoyado con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) R01 DE027689 y K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. y F31 DE029364 a B.J.C.D.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
imágenes de quimioluminiscencia
CO2 incubadora, camisa de aireVWR10810-902
tablero, 11 x 13 pulgadasFisher Scientific09 002 12
Célula de electroforesis, 4 geles, para mini geles prefabricados con módulo mini trans-blotBio-Rad1658030
Horno de hibridaciónMicrocentrífuga Fisher ScientificUVP95003001
5415 D con rotor F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini baño secoProductos de investigación International Corp400780
Agitador orbitalVWR89032-092
Medidor de pHVWR89231-662
Fuente de alimentación para SDS-PAGEBio-Rad1645050
Bandeja de hielo rectangular, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Microscopio estereoscópico Stemi 508 con soporte K Lab, anillo de luz LEDZeiss4350649020000000microscopio de disección
TemporizadorVWR62344-641
Revólver de tuboFisher Scientific11 676 341
Mezclador de vórticeFisher Scientific02 215 414
Baño de aguaVWR89501-472
blot boxFisher ScientificNC9358182
Materiales
Placas de cultivo celular, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Placas de cultivo celular, 12 pocillosFisher Scientific07-200-82
Elevadores de célulasFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Tubos cónicos, polipropileno, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 pinzas finasFine Science Tools11254-20
Cuchara para embrionesFine Science Tools10370-17
Tubos de microcentrífuga, 0,5 mLVWR89000-010
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL VWR20170-038
Pipeta Pasteur, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Pipeta Pasteur, 9"VWR14672-380
Placas de Petri, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Placas de Petri, 35 mmFisher Scientific
Bolsas, transparente, revestimiento de polietilenoFisher Scientific01-812-25B
Membrana de PVDFFisher Pinza ScientificIPVH00010
Semken FineScience Tools11008-13
Bombilla de látex pequeña, 2 mLVWR82024-554
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14002-12
Filtro de jeringa, 25 mm, 0,2 μ m tamaño de poroFisher Scientific09-740-108
Jeringa con punta Luer, 10 mLVWRBD309604
pipeta de transferenciaFisher Scientific13-711-22
Palanca de apertura de casete Western blotBio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr papel de cromatografíaFisher Scientific05-714-5
Reactivos
4-15% Geles de proteínas prefabricadas, 10 pocillos, 30 y micro; LBio-Rad4561083
β-glicerofosfato sódico sal hidratoSigma AldrichG5422-25G concentración deexistencias 1 M
β-mercaptoetanolSigma AldrichM3148-100ML
Albúmina sérica bovina, fracción V, prueba de choque térmicoFisher ScientificBP1600-100
Azul de bromofenolFisher Scientific
Cóctel completo de mini inhibidores de la proteasaSigma Aldrichdestock de 11836153001 25x
Kit de ensayo de proteínas DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, alta glucosaGibco11965092
E7, anticuerpo primario de beta tubulina monoclonal de ratón, concentrado 0,1 mLEstudios del desarrollo Banco de hibridomasE71:1.000
Sustrato de Western Blot ECLFisher ScientificPI32106rango de picogramos
bajo ECL sustrato de Western blotGenesee Scientific20-302Brango de femtogramo bajo
Tampón de electroforesis, 5 LBio-Rad1610772concentración de stock 10x
Etanol, 200 pruebas, 1 galónDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Ácido etilendiaminotetraacético, dihidra de sal de Di Na. (Poder cristalino/Electróforo.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Suero fetal bovino, caracterizado, origen estadounidense, 500 mLHyCloneSH30071.03
Glicerol (certificado ACS)Fisher ScientificG33-4
Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra anti-ratón IgGImmunoResearch Laboratories115-035-146:20.000
Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra IgG anti-conejo JacksonImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20.000
Solución de ácido clorhídrico, 6N (certificado)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 detergente no iónicoFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutaminaGibco25030081concentración de existencias 200 mM
MetanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) anticuerpo primarioTecnología de señalización celular9102S1:1.000; anti-Erk1/2
PDGF-BB ligando recombinante, rataFisher Scientific520BB050
PDGF Receptor y beta; anticuerpo primarioTecnología de señalización celular3169S1:1.000
Penicilina-EstreptomicinaGibco 15140122concentración de stock 100 U/mL, 100 y micro; g/mL
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo, 99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; concentración de existencias 100 mM
Anticuerpo primario Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Tecnología de señalización celular9101S1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2
Receptor de fosfo-PDGF y alfa; /Receptor de PDGF y beta; anticuerpo primarioTecnología de señalización celular3170S1:1.000
Cloruro de potasio (cristales blancos)Fisher ScientificBP366-500KCl
Fosfato de potasio monobásico (cristales blancos)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS, 10%Bio-Rad161-0416
Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado)Fisher ScientificS671-3NaCl
Fluoruro de sodio (polvo/ACS certificado)Fisher ScientificS299-100NaF; alícuota para un solo uso; concentración de existencias 1
M Ortovanadato de sodio, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; concentración de existencias 100 mM
Fosfato de sodio dibásico anhidro (granular o en polvo/ACS certificado)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Cultivo de tejidos PBSFisher Scientific21-031-CV
Tampón de transferencia, 5 LBio-Rad1610771concentración de stock 10x
Tris base (cristales blancos o polvo cristalino/biología molecular)Fisher ScientificBP152-1
TripsinaBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
blot marcador de peso molecularBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareInstitutos Nacionales de Salud
Animals
Hembra ratones 129S4regalo del Dr. Philippe Soriano, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai
Block para mini baño seco Research Products International Corp 400783 sistema de imagen ChemiDoc XRS+ con software Image Lab Bio-Rad 1708265 generador de Disección Western FB0875711YZ AC403140050 Concentración de Jackson 1 Western

Referencias

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

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