El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo analizar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar. Además, se recomiendan varias herramientas y recursos para investigar más a fondo las características de secuencia de las microproteínas identificadas para obtener información sobre sus supuestas funciones.
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Artículo de método
Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias
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En este artículo
Resumen
Resumen
La secuenciación de próxima generación (NGS) ha impulsado el campo de la genómica hacia adelante y ha producido secuencias del genoma completo para numerosas especies animales y organismos modelo. Sin embargo, a pesar de esta gran cantidad de información de secuencia, los esfuerzos integrales de anotación de genes han demostrado ser un desafío, especialmente para las proteínas pequeñas. En particular, los métodos convencionales de anotación de proteínas se diseñaron para excluir intencionalmente las proteínas putativas codificadas por marcos de lectura abiertos cortos (sORF) de menos de 300 nucleótidos de longitud para filtrar el número exponencialmente mayor de sORFs espurios no codificantes en todo el genoma. Como resultado, cientos de pequeñas proteínas funcionales llamadas microproteínas (<100 aminoácidos de longitud) se han clasificado incorrectamente como ARN no codificantes o se han pasado por alto por completo.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para aprovechar las herramientas bioinformáticas gratuitas y disponibles públicamente para consultar las regiones genómicas en busca de potencial de codificación de microproteínas basado en la conservación evolutiva. Específicamente, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo examinar la conservación de la secuencia y el potencial de codificación utilizando frecuencias de sustitución de codones filogenéticos (PhyloCSF) en el navegador del genoma fácil de usar de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC). Además, detallamos los pasos para generar de manera eficiente alineaciones de múltiples especies de secuencias de microproteínas identificadas para visualizar la conservación de la secuencia de aminoácidos y recomendamos recursos para analizar las características de las microproteínas, incluidas las estructuras de dominio predichas. Estas poderosas herramientas se pueden utilizar para ayudar a identificar secuencias supuestas de codificación de microproteínas en regiones genómicas no canónicas o para descartar la presencia de una secuencia de codificación conservada con potencial de traducción en una transcripción no codificante de interés.
Introducción
La identificación del conjunto completo de elementos codificantes en el genoma ha sido un objetivo importante desde el inicio del Proyecto Genoma Humano, y sigue siendo un objetivo central hacia la comprensión de los sistemas biológicos y la etiología de las enfermedades de base genética 1,2,3,4. Los avances en las técnicas ngs han llevado a la producción de secuencias del genoma completo para un gran número de organismos, incluidos vertebrados, invertebrados, levaduras y plantas5. Además, los métodos de secuenciación....
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Protocolo
El protocolo que se describe a continuación detalla los pasos para cargar y navegar por las pistas del navegador PhyloCSF en el UCSC Genome Browser (generado por Mudge et al.49). Para preguntas generales sobre el UCSC Genome Browser, se puede encontrar una extensa Guía del usuario de Genome Browser aquí: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.
1. Carga del PhyloCSF Track Hub en el ucsc genome browser
- Abra una ventana del navegador de Internet y navegue hasta el UCSC Genome Browser (
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Resultados
Aquí usaremos la microproteína mitoregulina validada (Mtln) como ejemplo para demostrar cómo un sORF conservado generará una puntuación PhyloCSF positiva que se puede visualizar y analizar fácilmente en el UCSC Genome Browser. La mitoregulina se anotó previamente como un ARN no codificante (anteriormente ID del gen humano LINC00116 y ID del gen de ratón 1500011K16Rik). La genómica comparativa y los métodos de análisis de conservación de secuencias desempeñaron un papel crítico en su descubrimiento inici.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo interrogar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar 48,49,50,51. Como se detalló anteriormente, PhyloCSF es un poderoso algoritmo de genómica comparativa que integra modelos filogenéticos y frecuencias de sust.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (HL-141630 y HL-160569) y la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati (Premio Del Fideicomisario).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Website | Website Address | Requirements | |
| Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool | https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ | Navegador | webPrograma de alineación de secuencias múltiples para la alineación eficiente de secuencias FASTA (es decir, para la comparación entre especies de microproteínas identificadas) |
| COXPRESSdb | https://coxpresdb.jp | Navegador web | Proporciona relaciones génicas correguladas para estimar las funciones de los genes |
| Preguntas frecuentes sobre las herramientas de bioinformática EMBL-EBI | https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ | Preguntas | frecuentes (FAQs) del navegador web sobre las herramientas EMBL-EBI. Incluye la clave de codificación por colores para las alineaciones de secuencias de proteínas |
| Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI), Herramientas y recursos de datos | https://www.ebi.ac.uk/services/all | Navegador web | Lista completa de sitios web, herramientas y recursos de datos disponibles gratuitamente |
| Expasy - Portal | Suizo de Recursos Bioinformáticoshttps://www.expasy.org | Navegador web | Conjunto de herramientas y recursos bioinformáticos para el análisis de secuencias de proteínas mantenido por el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) |
| Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Búsqueda | de dominio conservadohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi | Navegador web | Herramienta de búsqueda para identificar dominios conservados dentro de secuencias de proteínas o nucleótidos codificantes |
| Pfam 35 | http://pfam.xfam.org | Navegador web | Base de datos de la familia de proteínas (Pfam), proporciona alineaciones y clasificación de familias y dominios de proteínas |
| PhyloCSF Track Hub Descripción | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth | Navegador web | Descripción detallada de las pistas Smoothed PhyloCSF y PhyloCSF Track Hub |
| SignalP 6.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0 | Navegador web | Predice la presencia de péptidos señal y la ubicación de sus sitios de escisión |
| TMHMM - 2.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0 | Navegador web | Predicción de hélices transmembrana en proteínas |
| UCSC Genome Browser BLAT Search | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat | Navegador web | Herramienta utilizada para encontrar regiones genómicas utilizando información de secuencia de ADN o proteínas |
| UCSC Genome Browser Gateway | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway | Navegador web | Enlace directo al Navegador del genoma de la UCSC Portal del |
| de la UCSC Inicio | https://genome.ucsc.edu/ | Navegador web | Sitio web principal del Navegador del Genoma |
| de la UCSC Navegador del genoma de la UCSC Rastree los centros de | datoshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs | Navegador web | Enlace directo a la base de datos Track Data Hubs/Public Hubs para buscar y cargar la Guía del usuario del navegador del genoma PhyloCSF Tracks |
| UCSC | https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html | Navegador web | Guía de usuario completa que detalla cómo navegar por el navegador del genoma UCSC |
| WoLF PSORT | a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp | Navegador web | Herramienta de predicción de localización subcelular de proteínas |
Referencias
- Collins, F. S., Morgan, M., Patrinos, A. The human genome project: lessons from large-scale biology. Science. 300 (5617), 286-290 (2003).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Sachidanandam, R., <....
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Reimpresiones y permisos
