Reproducibilidad y precisión mejoradas de la cuantificación de alto rendimiento de los datos de crecimiento bacteriano mediante un lector de microplacas

Summary

Aquí, se presenta un protocolo de alto rendimiento para medir los datos de crecimiento, incluidas las curvas de crecimiento, la tasa de crecimiento y la tasa máxima de crecimiento. El protocolo se verificó y validó utilizando dos bacterias productoras de biopelícula. Los resultados y el enfoque aplicado en este estudio pueden ampliarse a otros protocolos de alto rendimiento que utilizan lectores de microplacas.

Abstract

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo repetible, confiable y de alto rendimiento para monitorear el crecimiento bacteriano en placas de 96 pocillos y analizar la tasa máxima de crecimiento. Se determinaron las curvas de crecimiento y las tasas máximas de crecimiento de dos especies bacterianas. Se investigaron cuestiones como (i) la condensación de la tapa, (ii) la corrección de la longitud de la trayectoria, (iii) el tamaño de la inoculación, (iv) el intervalo de tiempo de muestreo y (v) el sesgo espacial. La repetibilidad del protocolo se evaluó con tres réplicas técnicas independientes, con una desviación estándar de 0,03 entre las corridas. Las tasas máximas de crecimiento de Bacillus mycoides y Paenibacillus tundrae fueron (media ± DE) 0,99 h⁻¹ ± 0,03 h⁻¹ y 0,85 h⁻¹ ± 0,025 h⁻¹, respectivamente. Estas bacterias son más difíciles de controlar ópticamente debido a su afinidad por agruparse. Este estudio demuestra la importancia crítica del tamaño de la inoculación, la corrección de la longitud de la trayectoria, el calentamiento de la tapa, los intervalos de tiempo de muestreo y el sesgo espacial de la placa del pocillo para obtener datos confiables, precisos y reproducibles en los lectores de microplacas. El protocolo desarrollado y sus pasos de verificación pueden ampliarse a otros métodos utilizando lectores de microplacas y protocolos de alto rendimiento, lo que reduce los errores innatos de los investigadores y los costes de material.

Introduction

El creciente interés en la manipulación multiómica, incluidos los estudios mecanicistas y metabólicos de las bacterias, enfatiza la importancia de los métodos automatizados y de alto rendimiento, como el registro de datos de crecimiento ^1,2. Los datos de crecimiento que comprenden parámetros cinéticos, como las tasas máximas de crecimiento, pueden ayudar a caracterizar las respuestas bacterianas a diferentes condiciones físicas, químicas y antibacterianas. Los datos de la tasa de crecimiento son una variable de respuesta estándar que se utiliza para descu....

Protocol

NOTA: Todos los pasos de este protocolo deben seguirse en condiciones estériles (es decir, entre dos llamas o una cabina de bioseguridad). Todos los materiales y herramientas se esterilizan en autoclave durante 20 min. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo. Las manos enguantadas se desinfectan, se mantienen húmedas con desinfectante de manos o solución de alcohol al 70% durante al menos 1 minuto y no se retiran del armario de seguridad después. De lo contrario, se debe repetir el procedimiento de desinfección antes de volver a introducir las manos en el armario....

Results

Validación de la lectura del diámetro exterior y factor de corrección de la longitud del trayecto
Se tomaron muestras divididas de cultivo de B. mycoides en diferentes puntos de tiempo y se midieron utilizando el lector de microplacas y el espectrofotómetro (Figura 1A). Este paso se llevó a cabo para validar los resultados en diferentes dispositivos. Los datos de OD₆₀₀ se correlacionaron, pero no coincidieron (Figura 1B). .......

Discussion

Los lectores de microplacas permiten obtener tasas de crecimiento consistentes y repetibles. Esta tecnología minimiza el error humano y permite un muestreo de alto rendimiento. La pequeña cantidad de cultivo requerida por muestra hace que este enfoque sea una alternativa atractiva y de bajo costo a los recuentos de células que utilizan matraces o tubos de ensayo. Los lectores de microplacas permiten un gran tamaño de muestra, lo que aumenta el poder estadístico y, en consecuencia, facili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrífuga	Eppendorf	5810 R
- 15 mL	ThermoFisher- Científico	339650
Tubos de centrífuga estériles - 50 mL	ThermoFisher- Científico	339652
Asa de inoculación desechable estéril, 10 µ L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Matraces estériles
Erlenmeyer - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Vidrio
Isopropanol	ThermoFisher- Científico	396982500	≥ 99.0
Tampón de fosfato salino	Sigma-Aldrich	P4417
Puntas de pipeta 1.000 µ L	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-76
Puntas de pipeta 10 mL	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-83
Puntas de pipeta 200 µ L	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-85
Puntas de pipeta 5 mL	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-80
Pipeta 1.000 y micro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipeta 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipeta 200 y micro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipeta 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Caldo de soja tríptico	Millipore	22091	Apto para microbiología