Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Con la amplia aplicación de tecnologías de secuenciación, se han descubierto muchas secuencias nuevas similares a virus en artrópodos, incluidos los mosquitos. Las dos categorías principales de estos nuevos virus asociados a mosquitos son "virus transmitidos por mosquitos (MBV)" y "virus específicos de mosquitos (MSV)". Estos nuevos virus podrían ser patógenos tanto para los vertebrados como para los mosquitos, o simplemente podrían ser simbióticos con los mosquitos. Los virus de entidad son esenciales para confirmar las características biológicas de estos virus. Por lo tanto, aquí se ha descrito un protocolo detallado para el aislamiento y la amplificación del virus de los mosquitos recolectados en el campo. Primero, las muestras de mosquitos se prepararon como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Después de la centrifugación dos veces, los sobrenadantes se inocularon en la línea celular de mosquito C6/36 o en la línea celular de vertebrados BHK-21 para la amplificación del virus. Después de 7 días, los sobrenadantes se recolectaron como sobrenadantes P1 y se almacenaron a -80 °C. A continuación, los sobrenadantes P1 se pasaron dos veces más en las células C6/36 o BHK-21 mientras se verificaba diariamente el estado de la célula. Cuando se descubrió el efecto citopatogénico (CPE) en las células, estos sobrenadantes se recolectaron y se utilizaron para identificar virus. Este protocolo sirve como base para futuras investigaciones sobre virus asociados a mosquitos, incluidos MBV y MSV.
Introducción
Los mosquitos son un grupo de importantes artrópodos patógenos vectores. Hay aproximadamente 3.500 especies de mosquitos en la familia Culicidae 1,2. El desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de muchas secuencias novedosas similares a virus en mosquitos de diferentes partes del mundo3. En general, estos virus asociados a mosquitos se pueden clasificar en dos grupos principales: MBV y MSV.
Los MBV son un grupo de virus diversos que son agentes causantes de muchas enfermedades humanas o animales, como el virus de la fiebre amarilla (YFV), el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus del Nilo Occidental (WNV) y el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV)4. Han amenazado gravemente la salud pública al causar morbilidad y mortalidad graves tanto en humanos como en animales en todo el mundo. Los MBV mantienen naturalmente un ciclo de vida entre diversos huéspedes a través de la transmisión de un mosquito infectado a un huésped ingenuo, así como de un huésped infectado por virus y a un mosquito que se alimenta5. Por lo tanto, estos virus pueden infectar tanto líneas celulares de mosquitos como líneas celulares de vertebrados en el laboratorio1.
Los MSV, que incluyen el virus Yichang (YCN), el flavivirus Culex (CxFV) y el virus Chaoyang (CHAOV), son un subgrupo de virus específicos de insectos 1,6,7. En los últimos años, ha habido un aumento en el descubrimiento de nuevos MSV, y se ha encontrado que algunos de estos MSV tienen un impacto en la transmisión de MBV. Por ejemplo, CxFV, que puede ser una infección persistente en Culex pipiens, podría suprimir la replicación del VNO en una etapa temprana8. Se ha encontrado que otro flavivirus específico de insectos, el virus del agente fusionador celular (CFAV), inhibe la propagación del virus DENV y Zika (ZIKV) en mosquitos Aedes aegypti 9. Por lo tanto, este protocolo es un enfoque útil para aislar los virus asociados a los mosquitos y puede ayudar en futuras investigaciones sobre la distribución de patógenos relacionados con los mosquitos y el control de las enfermedades transmitidas por mosquitos.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Muestreo y clasificación de mosquitos
- Atrape a los mosquitos adultos a través de las trampas de luz MXA-02 o trampas de mosquitos de dióxido de carbono en el campo.
- Mata a los mosquitos recolectados sumergiéndolos en nitrógeno líquido10,11. Transportarlos al laboratorio mediante el sistema logístico de cadena de frío12.
NOTA: El hielo seco se utilizó principalmente en el sistema logístico de la cadena de frío. - (Opcional) Si los sitios de muestra estaban cerca del laboratorio, envíe directamente los mosquitos vivos en las trampas de red al laboratorio y eutanasiéselos congelándolos a ≤-20 ° C durante 30 min4.
- Realizar una identificación morfológica de los mosquitos recolectados a través del libro de herramientas13 para clasificación e identificación de mosquitos.
NOTA: Si es necesario, el código de barras de ADN podría usarse para clasificar e identificar mosquitos14,15. - Según las fechas y los sitios de muestreo, asígnelos en diferentes grupos y luego guárdelos en tubos de 2 a 5 ml.
- Dibuje una tabla para registrar cada tubo con especies de mosquitos, número, código de muestreo, fecha y sitios.
- Imprima las etiquetas con códigos de muestreo y péguelas a los tubos.
- Mantener los tubos con las muestras de mosquitos a -80 °C hasta un análisis adicional.
2. Molienda de mosquitos
- Coloque 20-50 mosquitos en cada tubo estéril de 2 ml con perlas de cerámica de 3 mm con 1.5 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) que contenga una solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%.
NOTA: Mantenga los tubos en hielo o en una bandeja agradable. - Homogeneizar los mosquitos con un homogeneizador de tejidos a baja temperatura moliendo durante 30 s a 70 Hz a 4 °C durante tres ciclos16.
- Centrifugar las mezclas a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos.
- Centrifugar de nuevo los sobrenadantes a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos de mosquitos12,17.
NOTA: Si es necesario, los sobrenadantes se pueden filtrar utilizando filtros de 0,22 μm. - Alícuota los sobrenadantes (P0) en tubos de almacenamiento de tapón de rosca de 2 ml (200 μL por tubo) y almacénelos a -80 °C.
3. Preparación de células y medio de mantenimiento de cultivos celulares
NOTA: La línea celular de mosquito C6/36 (Aedes albopictus RNAi-deficiente) y la línea celular de vertebrados BHK-21 (riñón de hámster bebé) se utilizaron para la amplificación y aislamiento del virus.
- Inocular 1 × 106 células C6/36 en un matraz de 75 cm2 con 10 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 28 °C en una incubadora humidificada conCO2 al 5%.
- Inocular 1 × 106 células BHK-21 en un matraz de 75 cm2 con 10 ml de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
NOTA: Las celdas fueron pasadas dos o tres veces por semana17,18. - Sembrar las células cultivadas en un matraz de 75cm2 (células C6/36 o BHK-21) en las placas de 24 pocillos (C6/36 por pocillo: 1,4 × 105; BHK-21 por pozo: 0,8 × 105).
- Coloque las placas de 24 pocillos a 28 °C o 37 °C durante la noche.
- Observe las células bajo el microscopio y confirme si la confluencia celular en cada pocillo es del 80% al 90%.
- Preparar el medio de mantenimiento del cultivo celular (500 mL).
NOTA: Para C6/36, el medio fue medio RPMI suplementado con FBS al 2% y solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%. Para BHK-21, el medio fue medio DMEM suplementado con FBS al 2% y solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%.
4. Aislamiento de virus
NOTA: Todos los pasos se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El requisito de nivel de seguridad del laboratorio de bioseguridad se determinó mediante la evaluación de riesgos de seguridad de la biotecnología basada en las regulaciones de diferentes países y regiones. El proceso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad.
- Retirar el medio de cultivo celular de las placas de 24 pocillos y añadir 100 μL del medio de mantenimiento del cultivo celular y 100 μL del sobrenadante del homogeneizado del mosquito (P0) a cada pocillo.
- Incubar las placas a 28 °C o 37 °C durante 60 min y agitarlas suavemente cada 15 min para evitar que las células se sequen.
- Retire el sobrenadante y enjuague suavemente cada pozo con 600 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular para eliminar los residuos por completo.
- Agregue 800 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo y mantenga las placas en una incubadora humidificada deCO2 al 5% a 28 °C o 37 °C durante 7 días.
- Monitorear el estado celular de cada pocillo bajo el microscopio diariamente15.
- Recoger los sobrenadantes de las células (sobrenadantes P1) el7º día y almacenar los sobrenadantes a -80 °C.
- Repita los pasos 4.1-4.6 2x para obtener sobrenadantes P2 y P3.
NOTA: En el paso 4.3, enjuagar cada pocillo suavemente con 600 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular fue opcional para P2 y P3. - Dependiendo de qué pozo muestra el efecto citopatogénico (CPE): las células mueren, la picnosis y se desprenden de la superficie; fusión con células adyacentes para formar sincitia; o la aparición de cuerpos de inclusión nucleares o citoplasmáticos: agregue 300-400 μL del sobrenadante de este CPE en cada pocillo de las nuevas placas de 6 pocillos que contienen células (la confluencia celular fue del 80% -90%) para amplificar en gran medida los virus.
- Recoger los sobrenadantes y alícuotas en tubos de almacenamiento de tapón de rosca de 2 ml (500 μL por tubo). Guárdelos a -80 °C.
NOTA: Después de tres generaciones de paso sucesivo en las células, las muestras que no indujeron CPE fueron descartadas. Si es necesario, se pueden aumentar las generaciones de pases sucesivos en las células.
5. Detección de secuencias virales por RT-PCR
- Extraer ARN total de 200 μL del sobrenadante viral utilizando un mini kit de ARN viral16.
NOTA: Aquí, se utilizó un sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos para extraer el ARN total siguiendo las instrucciones del fabricante del instrumento. - Convierta el ARN en ADNc siguiendo las instrucciones del kit RT-PCR utilizando un instrumento de PCR.
- Agregue 15 μL de ARN mezclado con 1 μL de cebadores aleatorios en el tubo de PCR. Coloque el tubo a 70 °C durante 5 min y luego colóquelo en hielo durante 5 min.
- Añadir 5 μL de tampón 5x y 25 μL de mezcla (10 mM dNTP, 40 U/μL de inhibidor de la RNasa y 200 U/μL M-MLV) en el tubo y colocar el tubo a 42 °C durante 60 min y 95 °C durante 10 min.
- Conservar el tubo a -20 °C.
- Utilice un kit de PCR y cebadores universales (Tabla 1) para detectar virus por PCR.
- Para los arbovirus, configure el sistema de reacción por PCR (total 30 μL) con los siguientes componentes: 3 μL de tampón Taq 10x, 3 μL de dNTP (1mM), 1 μL de cebador directo (10 μm), 1 μL de cebador inverso (10 μm), 0,3 μL de Taq (10 U/μL), 19,7 μL deddH2Oy 2 μL de ADNc.
- Para la detección de flavivirus, configurar el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Para la detección de alfavirus, configurar el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Para la detección de bunyavirus, configure el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Detectar los productos de amplificación por PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y enviarlos para su análisis de secuenciación.
NOTA: Si las condiciones lo permiten, los sobrenadantes pueden someterse a un análisis de secuenciación de próxima generación para identificar nuevos virus y obtener la secueundancia completa del genoma viral.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Después de la inoculación con los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito (P0), las células C6/36 exhibieron un amplio espacio intercelular, y las células exfoliadas se observaron a las 120 h (Figura 1A) en comparación con las células no inoculadas (control) al mismo tiempo (Figura 1B). Después de incubar las células BHK-21 con los sobrenadantes P3, se observó CPE visible en las células BHK-21 a las 48 h (Figura 1C) en cont...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El objetivo de este método era ofrecer una forma práctica de aislar virus asociados a mosquitos utilizando varias líneas celulares. Es fundamental añadir el antibiótico-antimicótico (penicilina-estreptomicina-anfotericina) a los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito para evitar la contaminación por bacterias u hongos. Los mosquitos y sobrenadantes virales obtenidos en el campo deben refrigerarse a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
Otro paso crítico e...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m filtro de membrana | Millipore SLGP033RB | Películas poliméricas con clasificaciones de poros específicas. Para eliminar los restos celulares y las bacterias. | |
| Placas de 24 pocillos | CORNING | 3524 | Recipientes para |
| matraces de 75 cm2 | CORNING | 430641 | Recipientes para célula |
| un tubo estéril de 2 mL con perlas | |||
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240-062 | Antibiótico en el medio para evitar la contaminación por bacterias y hongos |
| Ácido nucleico automatizado sistema de extracción | NanoMagBio | S-48 | |
| células BHK-21 | Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología | ||
| Células C6/36 | Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología | ||
| Máquina centrífuga | Himac | CF16RN | Instrumento para la centrifugación de muestras de mosquitos |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s medio esencial mínimo (DMEM) | Gibco | medio C11995500BT | para líneas celulares de vertebrados |
| Aislamiento del virus | del lago Ebinur Cu20-XJ | ||
| Suero bovino feta (FBS) | Gibco | 10099141C | Proporcionar nutrición a las células |
| homogeneizador de tejidos de alta velocidad y baja temperatura | servicebio | KZ-III-F | Instrumento para molienda |
| incubadora (28 ° C) | Instrumento Panasonic | MCO-18AC | cultivo celular |
| (37 ° C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrumento para cultivo celular |
| Tubo | |||
| PCR penicilina-estreptomicina | Gibco | 15410-122 | Antibiótico en el medio para prevenir la contaminación por bacterias |
| Penicilina-estreptomicina-anfotericina B Solución | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerador (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medio para líneas celulares de mosiquto |
| Tubos de almacenamiento con tapón de rosca (2 mL) | biofil | ||
| morteros estériles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumibles para molienda |
| TGrinder OSE-Y30 trituradora de tejidos eléctrica | Tiangen | OSE-Y30 | Instrumento para molienda |
| El microscopio de disección | ZEISS | Stemi508 | |
| Las trampas de luz MXA-02 | Maxttrac | ||
| La máquina | absorbedora de mosquitosNingbo Bangning | ||
| Las puntas de pipeta | Axygen | TF | |
| El mini kit de ARN viral QIAamp | QIAGEN | 52906 | |
| Pinzas | Dumont | 0203-5-PO |
Referencias
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342(2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265(2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873(2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30(2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555(2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640(2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298(2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
