Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.
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Artículo de método
Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo
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Resumen
Resumen
Con la amplia aplicación de tecnologías de secuenciación, se han descubierto muchas secuencias nuevas similares a virus en artrópodos, incluidos los mosquitos. Las dos categorías principales de estos nuevos virus asociados a mosquitos son "virus transmitidos por mosquitos (MBV)" y "virus específicos de mosquitos (MSV)". Estos nuevos virus podrían ser patógenos tanto para los vertebrados como para los mosquitos, o simplemente podrían ser simbióticos con los mosquitos. Los virus de entidad son esenciales para confirmar las características biológicas de estos virus. Por lo tanto, aquí se ha descrito un protocolo detallado para el aislamiento y la amplificación del virus de los mosquitos recolectados en el campo. Primero, las muestras de mosquitos se prepararon como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Después de la centrifugación dos veces, los sobrenadantes se inocularon en la línea celular de mosquito C6/36 o en la línea celular de vertebrados BHK-21 para la amplificación del virus. Después de 7 días, los sobrenadantes se recolectaron como sobrenadantes P1 y se almacenaron a -80 °C. A continuación, los sobrenadantes P1 se pasaron dos veces más en las células C6/36 o BHK-21 mientras se verificaba diariamente el estado de la célula. Cuando se descubrió el efecto citopatogénico (CPE) en las células, estos sobrenadantes se recolectaron y se utilizaron para identificar virus. Este protocolo sirve como base para futuras investigaciones sobre virus asociados a mosquitos, incluidos MBV y MSV.
Introducción
Los mosquitos son un grupo de importantes artrópodos patógenos vectores. Hay aproximadamente 3.500 especies de mosquitos en la familia Culicidae 1,2. El desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de muchas secuencias novedosas similares a virus en mosquitos de diferentes partes del mundo3. En general, estos virus asociados a mosquitos se pueden clasificar en dos grupos principales: MBV y MSV.
Los MBV son un grupo de virus diversos que son agentes causantes de muchas enfermedades humanas o animales, como el viru....
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Protocolo
1. Muestreo y clasificación de mosquitos
- Atrape a los mosquitos adultos a través de las trampas de luz MXA-02 o trampas de mosquitos de dióxido de carbono en el campo.
- Mata a los mosquitos recolectados sumergiéndolos en nitrógeno líquido10,11. Transportarlos al laboratorio mediante el sistema logístico de cadena de frío12.
NOTA: El hielo seco se utilizó principalmente en el sistema logístico de la cadena de frío. - (Opcional) Si los sitios de muestra estaban cerca del laboratorio, envíe directamente los mosquitos vivos en las trampas de re....
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Resultados
Después de la inoculación con los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito (P0), las células C6/36 exhibieron un amplio espacio intercelular, y las células exfoliadas se observaron a las 120 h (Figura 1A) en comparación con las células no inoculadas (control) al mismo tiempo (Figura 1B). Después de incubar las células BHK-21 con los sobrenadantes P3, se observó CPE visible en las células BHK-21 a las 48 h (Figura 1C) en cont.......
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Discusión
El objetivo de este método era ofrecer una forma práctica de aislar virus asociados a mosquitos utilizando varias líneas celulares. Es fundamental añadir el antibiótico-antimicótico (penicilina-estreptomicina-anfotericina) a los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito para evitar la contaminación por bacterias u hongos. Los mosquitos y sobrenadantes virales obtenidos en el campo deben refrigerarse a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
Otro paso crítico e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m filtro de membrana | Millipore SLGP033RB | Películas poliméricas con clasificaciones de poros específicas. Para eliminar los restos celulares y las bacterias. | |
| Placas de 24 pocillos | CORNING | 3524 | Recipientes para |
| matraces de 75 cm2 | CORNING | 430641 | Recipientes para célula |
| un tubo estéril de 2 mL con perlas | |||
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240-062 | Antibiótico en el medio para evitar la contaminación por bacterias y hongos |
| Ácido nucleico automatizado sistema de extracción | NanoMagBio | S-48 | |
| células BHK-21 | Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología | ||
| Células C6/36 | Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología | ||
| Máquina centrífuga | Himac | CF16RN | Instrumento para la centrifugación de muestras de mosquitos |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s medio esencial mínimo (DMEM) | Gibco | medio C11995500BT | para líneas celulares de vertebrados |
| Aislamiento del virus | del lago Ebinur Cu20-XJ | ||
| Suero bovino feta (FBS) | Gibco | 10099141C | Proporcionar nutrición a las células |
| homogeneizador de tejidos de alta velocidad y baja temperatura | servicebio | KZ-III-F | Instrumento para molienda |
| incubadora (28 ° C) | Instrumento Panasonic | MCO-18AC | cultivo celular |
| (37 ° C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrumento para cultivo celular |
| Tubo | |||
| PCR penicilina-estreptomicina | Gibco | 15410-122 | Antibiótico en el medio para prevenir la contaminación por bacterias |
| Penicilina-estreptomicina-anfotericina B Solución | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerador (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medio para líneas celulares de mosiquto |
| Tubos de almacenamiento con tapón de rosca (2 mL) | biofil | ||
| morteros estériles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumibles para molienda |
| TGrinder OSE-Y30 trituradora de tejidos eléctrica | Tiangen | OSE-Y30 | Instrumento para molienda |
| El microscopio de disección | ZEISS | Stemi508 | |
| Las trampas de luz MXA-02 | Maxttrac | ||
| La máquina | absorbedora de mosquitosNingbo Bangning | ||
| Las puntas de pipeta | Axygen | TF | |
| El mini kit de ARN viral QIAamp | QIAGEN | 52906 | |
| Pinzas | Dumont | 0203-5-PO |
Referencias
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
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Reimpresiones y permisos
