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Artículo de método

Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo

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DOI:

10.3791/63852

31 de agosto de 2022

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.

Resumen

Con la amplia aplicación de tecnologías de secuenciación, se han descubierto muchas secuencias nuevas similares a virus en artrópodos, incluidos los mosquitos. Las dos categorías principales de estos nuevos virus asociados a mosquitos son "virus transmitidos por mosquitos (MBV)" y "virus específicos de mosquitos (MSV)". Estos nuevos virus podrían ser patógenos tanto para los vertebrados como para los mosquitos, o simplemente podrían ser simbióticos con los mosquitos. Los virus de entidad son esenciales para confirmar las características biológicas de estos virus. Por lo tanto, aquí se ha descrito un protocolo detallado para el aislamiento y la amplificación del virus de los mosquitos recolectados en el campo. Primero, las muestras de mosquitos se prepararon como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Después de la centrifugación dos veces, los sobrenadantes se inocularon en la línea celular de mosquito C6/36 o en la línea celular de vertebrados BHK-21 para la amplificación del virus. Después de 7 días, los sobrenadantes se recolectaron como sobrenadantes P1 y se almacenaron a -80 °C. A continuación, los sobrenadantes P1 se pasaron dos veces más en las células C6/36 o BHK-21 mientras se verificaba diariamente el estado de la célula. Cuando se descubrió el efecto citopatogénico (CPE) en las células, estos sobrenadantes se recolectaron y se utilizaron para identificar virus. Este protocolo sirve como base para futuras investigaciones sobre virus asociados a mosquitos, incluidos MBV y MSV.

Introducción

Los mosquitos son un grupo de importantes artrópodos patógenos vectores. Hay aproximadamente 3.500 especies de mosquitos en la familia Culicidae 1,2. El desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de muchas secuencias novedosas similares a virus en mosquitos de diferentes partes del mundo3. En general, estos virus asociados a mosquitos se pueden clasificar en dos grupos principales: MBV y MSV.

Los MBV son un grupo de virus diversos que son agentes causantes de muchas enfermedades humanas o animales, como el viru....

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Protocolo

1. Muestreo y clasificación de mosquitos

  1. Atrape a los mosquitos adultos a través de las trampas de luz MXA-02 o trampas de mosquitos de dióxido de carbono en el campo.
  2. Mata a los mosquitos recolectados sumergiéndolos en nitrógeno líquido10,11. Transportarlos al laboratorio mediante el sistema logístico de cadena de frío12.
    NOTA: El hielo seco se utilizó principalmente en el sistema logístico de la cadena de frío.
  3. (Opcional) Si los sitios de muestra estaban cerca del laboratorio, envíe directamente los mosquitos vivos en las trampas de re....

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Resultados

Después de la inoculación con los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito (P0), las células C6/36 exhibieron un amplio espacio intercelular, y las células exfoliadas se observaron a las 120 h (Figura 1A) en comparación con las células no inoculadas (control) al mismo tiempo (Figura 1B). Después de incubar las células BHK-21 con los sobrenadantes P3, se observó CPE visible en las células BHK-21 a las 48 h (Figura 1C) en cont.......

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Discusión

El objetivo de este método era ofrecer una forma práctica de aislar virus asociados a mosquitos utilizando varias líneas celulares. Es fundamental añadir el antibiótico-antimicótico (penicilina-estreptomicina-anfotericina) a los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito para evitar la contaminación por bacterias u hongos. Los mosquitos y sobrenadantes virales obtenidos en el campo deben refrigerarse a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.

Otro paso crítico e.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m filtro de membranaMillipore SLGP033RBPelículas poliméricas con clasificaciones de poros específicas. Para eliminar los restos celulares y las bacterias.
Placas de 24 pocillosCORNING3524Recipientes para
matraces de 75 cm2CORNING430641Recipientes para célula
un tubo estéril de 2 mL con perlas
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240-062Antibiótico en el medio para evitar la contaminación por bacterias y hongos
Ácido nucleico automatizado sistema de extracciónNanoMagBioS-48
células BHK-21Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología
Células C6/36Centro Nacional de Recursos de Virus, Instituto de Virología
Máquina centrífugaHimacCF16RNInstrumento para la centrifugación de muestras de mosquitos
CO2
Dulbecco' s medio esencial mínimo (DMEM)Gibcomedio C11995500BTpara líneas celulares de vertebrados
Aislamiento del virusdel lago Ebinur Cu20-XJ
Suero bovino feta (FBS)Gibco10099141C

Proporcionar nutrición a las células
homogeneizador de tejidos de alta velocidad y baja temperaturaservicebioKZ-III-FInstrumento para molienda
incubadora (28 ° C)Instrumento PanasonicMCO-18ACcultivo celular
(37 ° C)PanasonicMCO-18ACInstrumento para cultivo celular
Tubo
PCR penicilina-estreptomicinaGibco15410-122Antibiótico en el medio para prevenir la contaminación por bacterias
Penicilina-estreptomicina-anfotericina B SoluciónGibco15240096
Refrigerador (-80 ° C)sanyoMDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medio (RPMI)GibcoC11875500BTmedio para líneas celulares de mosiquto
Tubos de almacenamiento con tapón de rosca (2 mL)biofil 
morteros estérilesTiangenOSE-Y004Consumibles  para molienda
TGrinder OSE-Y30 trituradora de tejidos eléctricaTiangenOSE-Y30Instrumento para molienda
El microscopio de disecciónZEISSStemi508
Las trampas de luz MXA-02Maxttrac
La máquinaabsorbedora de mosquitosNingbo Bangning
Las puntas de pipetaAxygenTF
El mini kit de ARN viral QIAampQIAGEN52906
PinzasDumont0203-5-PO
de cerámica de 3 mmde Wuhande Wuhan para incubadora de de FCT010005

Referencias

  1. Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
  2. Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....

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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

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