Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.
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Artículo de método
* These authors contributed equally
Retraction Notice
This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.
Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.
El interés en la microscopía de electrones líquidos (EM líquido) se ha disparado en los últimos años, ya que los científicos ahora pueden observar procesos en tiempo real a nanoescala. Es extremadamente deseable combinar la información crio-EM de alta resolución con observaciones dinámicas, ya que muchos eventos ocurren en escalas de tiempo rápidas, en el rango de milisegundos o más rápido. Un mejor conocimiento de las estructuras flexibles también puede ayudar en el diseño de nuevos reactivos para combatir patógenos emergentes, como el SARS-CoV-2. Más importante aún, ver materiales biológicos en un ambiente fluido proporciona una visión única de su rendimiento en el cuerpo humano. Aquí se presentan métodos recientemente desarrollados para investigar las propiedades a nanoescala de los ensamblajes de virus en hielo líquido y vítreo. Para lograr este objetivo, se utilizaron muestras bien definidas como sistemas modelo. Se presentan comparaciones lado a lado de los métodos de preparación de muestras e información estructural representativa. Las características subnanométricas se muestran para estructuras resueltas en el rango de ~ 3.5-Å-10 Å. Otros resultados recientes que respaldan este marco complementario incluyen información dinámica de candidatos a vacunas y terapias basadas en anticuerpos fotografiadas en líquido. En general, estas aplicaciones correlativas mejoran nuestra capacidad de visualizar la dinámica molecular, proporcionando un contexto único para su uso en la salud y la enfermedad humanas.
La investigación biomédica mejora nuestra comprensión de la salud humana y la enfermedad a través del desarrollo de nuevas tecnologías. Las imágenes de alta resolución están transformando nuestra visión del nanomundo, permitiéndonos estudiar células y moléculas con exquisito detalle 1,2,3,4,5. La información estática de componentes dinámicos como polímeros blandos, ensamblajes de proteínas o virus humanos revela solo una instantánea limitada de su compleja narrativa. Para comprender mejor cómo operan las en....
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1. Carga del portamuestras para líquido-EM
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Se utilizó un TEM líquido que operaba a 200 kV para todos los experimentos de imágenes de EM líquida y un TEM criogénico que funcionaba a 300 kV para toda la recopilación de datos de crioEM. Se presentan imágenes y estructuras representativas de múltiples virus para demostrar la utilidad de los métodos en varios sujetos de prueba. Estos incluyen el virus adenoasociado recombinante subtipo 3 (AAV), los conjuntos subvirales del SARS-CoV-2 derivados del suero del paciente y las partículas de doble capa (DLP) del rotavirus s.......
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Se presentan nuevas oportunidades para agilizar los flujos de trabajo actuales de EM líquida mediante el uso de nuevas herramientas automatizadas y tecnologías adaptadas del campo crioelectromagnético. Las aplicaciones que involucran la nueva técnica de sándwich de microchip son significativas con respecto a otros métodos porque permiten el análisis de imágenes de alta resolución en hielo líquido o vítreo. Uno de los pasos más críticos en el protocolo es producir especímenes con el espesor de líquido ideal para visualiza.......
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. La autora, Madeline J. Dressel-Dukes, es empleada de Protochips, Inc. y Michael Spilman es empleado de DirectElectron.
Los autores reconocen al Dr. Luk H. Vandenberghe (Escuela de Medicina de Harvard, Departamento de Oftalmología) por proporcionar AAV-3 purificado. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Nacional del Cáncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetona | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Litro |
| Cargador automático herramienta de recorte | ThermoFisher Scientific | N/A | También SubAngstrom |
| proveedor Pinzas de rejilla de cargador automático | ThermoFisher Scientific | N/A | pinzas superior e inferior |
| Rejillas EM de oro recubiertas de carbono | Microcopy Sciences Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | Malla de 400 nm, 5 nm de espesor |
| suero para pacientes COVID-19 | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microlitros de metanol sérico PCR+ |
| Fisher | Scientific | A412-1 | Microchips de 1 litro |
| Micropozo-integrados | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | Matrices de ventanas de 10x10 mm |
| Microchips TEMWindows | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 ventanas grandes, TEM de 10 nn de grosorMicrochips |
| Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 ventanas pequeñas, 5 nm de grosor | |
| Los mejores microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | Ventana de 500 mm x 100 mm Papel |
| filtro Whatman #1 | Whatman | 1001 090 | 100 piezas, 90 mm |
| Equipo | |||
| electrones directo | Electrón | Espaciado de píxeles de 6 micras | |
| Detector de electrones directos Falcon 3 EC | ThermoFisher Scientific | Espaciado de píxeles de 14 micras | |
| Gatan 655 Estación de bombeo seco | Gatan, Inc. | Punta de soporte de bomba hasta 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | unidad de preparación de muestras de última generación | |
| PELCO easiGlow, unidad de descarga incandescente | Ted Pella, Inc. | Modo de polaridad negativa | |
| Poseidón Seleccionar portamuestras | Protochips, Inc. | Compatible con FEI; portamuestras | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Software de libre acceso | Enlace al sitio web | Comentarios (opcional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | otro software de procesamiento de imágenes | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | programa de búsqueda CTF | |
| MotionCorr2 | |||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | paquete de software de análisis de estructura molecular |
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