Artículo de método

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

DOI:

10.3791/63885

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31 de marzo de 2022

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1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

En este artículo

Resumen

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Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Resumen

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Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema son parásitos obligados de insectos que viven en el suelo. La principal característica de su ciclo de vida es la asociación mutualista con las bacterias Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente. Los parásitos nematodos son capaces de localizar e ingresar a los huéspedes de insectos adecuados, subvertir la respuesta inmune del insecto y multiplicarse de manera eficiente para producir la próxima generación que cazará activamente nuevas presas de insectos para infectar. Debido a las propiedades de su ciclo de vida, los nematodos entomopatógenos son agentes de control biológico populares, que se utilizan en combinación con insecticidas para controlar las plagas destructivas de insectos agrícolas. Simultáneamente, estos nematodos parásitos representan una herramienta de investigación para analizar la patogenicidad de los nematodos y las respuestas anti-nematodos del huésped. Esta investigación es ayudada por el reciente desarrollo de técnicas genéticas y enfoques transcriptómicos para comprender el papel de las moléculas secretadas por nematodos durante la infección. Aquí, se proporciona un protocolo detallado sobre el mantenimiento de nematodos entomopatógenos y el uso de un procedimiento de eliminación de genes. Estas metodologías promueven aún más la caracterización funcional de los factores de infección por nematodos entomopatógenos.

Introducción

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La investigación sobre nematodos entomopatógenos (NPP) se ha intensificado en los últimos años debido principalmente a la utilidad de estos parásitos en las estrategias de manejo integrado de plagas y su participación en la investigación biomédica básica 1,2. Estudios recientes han establecido la EPN como organismos modelo en los que examinar los componentes genéticos de los nematodos que se activan durante las diferentes etapas del proceso de infección. Esta información proporciona pistas críticas sobre la naturaleza y el número de moléculas secretadas por los parásitos para alterar la fisiología del huésped ....

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Protocolo

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1. Producción de juveniles infecciosos de nematodos simbióticos

  1. Cubra una placa de Petri (10 cm) con un trozo de papel de filtro y agregue aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A).
  2. Usando una pipeta, dispense 2 ml de agua que contenga aproximadamente 25-50 IJ por suspensión de 10 μL sobre los gusanos de cera. Guarde la placa de Petri en un gabinete a temperatura ambiente.
  3. Dependiendo de la humedad del papel de filtro, agregue 1-2 ml de agua cada 2 días. Los gusanos de cera infectados con IJ normalmente morirán dentro de las 48 h.
  4. Prepare las trampas d....

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Resultados

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Para evaluar el estado de los nematodos de H. bacteriophora que han pasado por la axenización, se determinó la presencia o ausencia de colonias bacterianas de P. luminescens en IJs. Para ello, se recogió un pellet de aproximadamente 500 IJ que habían sido previamente esterilizados en superficie y homogeneizados en PBS. El tratamiento de control positivo consistió en un pellet de aproximadamente 500 IJ del cultivo de nematodos que contenía bacterias simbióticas P. luminescens . Los gránulos de n.......

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Discusión

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Comprender las bases moleculares de la infección por nematodos entomopatógenos y la inmunidad antineomatodos de insectos requiere la separación de los parásitos de las bacterias mutuamente asociadas 13,15,16. Los nematodos entomopatógenos H. bacteriophora y S. carpocapsae conviven con las bacterias Gram-negativas P. luminescens y X. nematophila, respectivamente17. Se ha.......

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Divulgaciones

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Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a los miembros del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington por la lectura crítica del manuscrito. Todas las figuras gráficas se hicieron utilizando BioRender. Investigación en el I. E., J. H. y D. O'H. los laboratorios han sido apoyados por la Universidad George Washington y el Colegio Colombino de Artes y Ciencias facilitando fondos y Fondos de Investigación Interdisciplinaria.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaVWR97062-244
Ambion Megascript T7 KitThermo Fisher ScientificAM1333
AmpicilinaFisher Scientific611770250
Matraz de cultivo celular T25Fisher Scientific156367
Matraz de cultivo celular T75Fisher Scientific156499
ChoiceTaq MastermixDenville ScientificC775Y42
Aceite de maízVWR470200-112
Jarabe de maízMP Biomedicals/VWRIC10141301
Tubo de cultivo 10mL Fisher Scientific14-959-14
Eppendorf Femtotips Puntas de microcargador EppendorfE5242956003
etanolMillipore-SigmaE7023
Tubo Falcon 50 mLFisher Scientific14-432-22
Microinyector FemtojetEppendorf5252000021
Papel de filtroVWR28320-100
Galleria mellonella waxormsPetco-Glass
Fisher Scientific12-553-46450 x 24 mm
Aceite Halocarbon 700SigmaH8898
Asa de inoculaciónVWR12000-806
KanamicinaVWR97062-956
Kwik-Fil Capilares de vidrio de borosilicatoWorld Precision Instruments1B100F-31.0 mm
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar miller en polvo 500 g
LB CaldoFisher ScientificBP1426-500LB caldo miller en polvo 500 g
Leica DM IRB Microscopio de investigación invertidoMicroscopioCentral-MacConkey
medioMillipore-SigmaM7408-250G
MEGAclear Kit de limpieza de transcripciónThermo Fisher ScientificAM1908
Tubo de microcentrífugaVWR76332-0641,5 ml
NanoDrop 2000 EspectrofotómetroThermo Fisher ScientificND-2000
Jeringa de agujaVWRBD30515522G
Caldo de nutrientesMillipore-Sigma70122-100G
ParafilmVWR52858-076
Placa de Petri particionadaVWR490005-212
PBSVWR97062-732Tampón Comprimidos PBS Imprimaciones PCR de 200 lengüetas de grado biotecnológico
Azenta-Pestle
Millipore-SigmaBAF199230001Bel-Art Placa de Petri Desechable
6 cmVWR25384-09260 x 15 mm
Placa de Petri 10 mmVWR10799-19235 x 10 mm
Proteose Peptona #3Thermo Fisher Scientific
Levadura extractoMillipore-SigmaY1625
Cubreobjetos de vidrio 211693

Referencias

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  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Pa....

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