Artículo de método

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

DOI:

10.3791/63889

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17 de agosto de 2022

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1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Resumen

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La remodelación de la membrana ocurre constantemente en la membrana plasmática y dentro de los orgánulos celulares. Para diseccionar completamente el papel del medio ambiente (condiciones iónicas, composiciones de proteínas y lípidos, curvatura de membrana) y los diferentes socios asociados con procesos específicos de remodelación de membranas, emprendemos enfoques ascendentes in vitro . En los últimos años, ha habido un gran interés en revelar el papel de las proteínas septina asociadas con las principales enfermedades. Las septinas son proteínas citoesqueléticas esenciales y ubicuas que interactúan con la membrana plasmática. Están implicados en la división celular, la motilidad celular, la neuromorfogénesis y la espermiogénesis, entre otras funciones. Por lo tanto, es importante comprender cómo las septinas interactúan y se organizan en las membranas para inducir posteriormente deformaciones de la membrana y cómo pueden ser sensibles a curvaturas específicas de la membrana. Este artículo tiene como objetivo descifrar la interacción entre la ultraestructura de las septinas a nivel molecular y la remodelación de la membrana que se produce a escala micrométrica. Con este fin, la levadura en ciernes y los complejos de septina de mamíferos se expresaron y purificaron recombinantemente. Luego se utilizó una combinación de ensayos in vitro para analizar el autoensamblaje de septinas en la membrana. Se utilizaron bicapas lipídicas soportadas (SLB), vesículas unilamelares gigantes (GUV), vesículas unilamelares grandes (LUV) y sustratos ondulados para estudiar la interacción entre el autoensamblaje de septinas, la remodelación de la membrana y la curvatura de la membrana.

Introducción

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Las septinas son proteínas formadoras de filamentos citoesqueléticos que interactúan con las membranas lipídicas. Las septinas son ubicuas en los eucariotas y esenciales para numerosas funciones celulares. Han sido identificados como los principales reguladores de la división celular en levaduras y mamíferos en ciernes 1,2. Están involucrados en eventos de remodelación de membrana, ciliogénesis3 y espermiogénesis4. Dentro de las células de mamíferos, las septinas también pueden interactuar con actina y microtúbulos ....

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Protocolo

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1. Determinación de la remodelación de la membrana utilizando vesículas unilamelares gigantes (GUV)

NOTA: En esta sección, los GUV se generan para imitar las deformaciones de la membrana posiblemente inducidas por las septinas en un contexto celular. De hecho, en las células, las septinas se encuentran con frecuencia en sitios con curvaturas micrométricas. Los GUV tienen tamaños que van desde unos pocos hasta decenas de micrómetros y pueden deformarse. Por lo tanto, son apropiados para evaluar cualquier deformación inducida por septina a escala micrométrica. Los lípidos fluorescentes, así como las septinas marcadas con fluore....

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Resultados

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Deformaciones de GUVs
Las imágenes típicas de fluorescencia confocal de GUVs remodelados después de ser incubados con septinas se muestran en la Figura 3, en condiciones donde las septinas polimerizan. Los GUV desnudos (Figura 3A) eran perfectamente esféricos. Tras la incubación con más de 50 nM de filamentos de septina de levadura en ciernes, las vesículas parecían deformadas. Hasta una concentración de 100 nM de octámeros de septina de leva.......

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Discusión

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Como se indicó anteriormente, se ha utilizado una mezcla lipídica que mejora la incorporación de PI(4,5)P2 dentro de la bicapa lipídica y, por lo tanto, facilita las interacciones septina-membrana. De hecho, hemos demostrado en otra parte25 que las septinas de levadura en ciernes interactúan con las vesículas de una manera específica de PI(4,5)P2. Esta composición lipídica se ajustó empíricamente a partir del cribado de múltiples composiciones y ahora es ampliamente utilizada.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos a Patricia Bassereau y Daniel Lévy por sus útiles consejos y discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de la ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar el proyecto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, y el proyecto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin está financiado por la Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" y la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa fue apoyado por la Universidad de la Sorbona (AAP Emergence). G.H. Koenderink recibió el apoyo de la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) a través del 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Beca de gravitació....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminaÁvidos polares Avanti 850725
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serinaLípidos polares Avanti840035
Sonicador de bañoElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramidainvitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Productos químicos: NaCl, Tris-HCl, sacarosa, KCl, MgCl2, B-caseína, cloroformo, cacodilato de sodio, ácido tánico, etanolSigma Aldrich
Microscopio confocalnikono Confocal
Secador de punto críticoLeica microsystemsCPD300
Generador de agua desionizadaMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Huevos L-α- fosfatidilcolinaAvanti Polar Lipids840051
Pistola de emisión de campo SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehído 25 %, solución acuosaThermo Fischer scientific50-262-19
Grasa de alto vacío, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/Paquete de software para la alineación de imágenes en serie inclinada y la reconstrucción 3D
Lacey Formvar/rejillas de microscopía electrónica de carbonoEloise01883-F
LípidosAvanti Lípidos Polares
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfatoÁvidos Avanti Polar Evaporador840046
metalLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Adhesivos ópticos de Norland), NOA 71 y NOA 81Productos de NorlandNOA71, NOA81
Microscopías detetraóxido de osmio al 4%19170
OsmómetroLö ser15 M
Limpiador de plasmaAlcatelpascal 2005 SD
Generador de plasmaMicroscopía electrónica Ciencia
Equipo de congelación por inmersiónLeica MicrosystemsEMGP
Microscopio electrónico de transmisiónThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Acetato de uraniloMicroscopía electrónica Ciencia22451este producto ya no está disponible para su compra
Placas de cera, VitrexVWR
Disco giratorio delta

Referencias

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  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....

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