Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Summary

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Abstract

Con el fin de descifrar los complejos mecanismos moleculares que regulan el ensamblaje y desmontaje de los filamentos de actina, es un gran activo monitorear las reacciones individuales en vivo en condiciones bien controladas. Para hacerlo, han surgido experimentos en vivo de un solo filamento en los últimos 20 años, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), y han proporcionado un tesoro de resultados clave. En 2011, con el fin de ampliar aún más las posibilidades de estos experimentos y evitar artefactos problemáticos recurrentes, introdujimos microfluídica simple en estos ensayos. Este estudio detalla nuestro protocolo básico, donde los filamentos de actina individuales se anclan por un extremo a la superficie pasivada de la cubierta, se alinean con el flujo y pueden exponerse sucesivamente a diferentes soluciones proteicas. También presentamos los protocolos para aplicaciones específicas y explicamos cómo se pueden aplicar las fuerzas mecánicas controladas, gracias al arrastre viscoso de la solución que fluye. Destacamos las advertencias técnicas de estos experimentos y presentamos brevemente los posibles desarrollos basados en esta técnica. Estos protocolos y explicaciones, junto con la disponibilidad actual de equipos de microfluídica fáciles de usar, deberían permitir a los no especialistas implementar este ensayo en sus laboratorios.

Introduction

El montaje y desmontaje de filamentos de actina y redes de filamentos de actina están controlados por varias reacciones bioquímicas y dependen del contexto mecánico. Para obtener información sobre estos complejos mecanismos, es invaluable poder observar reacciones individuales en filamentos individuales (en cantidades suficientemente grandes). En las últimas décadas, la observación de filamentos dinámicos de actina en tiempo real, principalmente utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), se ha convertido en una técnica clave y ha proporcionado una impresionante lista de resultados que no se podrían haber obtenido con ensayos bioquímicos....

Protocol

1. Preparación de la cámara microfluídica

1. Seleccione un molde maestro SU-8 con varios patrones de cámara. Las cámaras típicas tienen forma de cruz con tres entradas y una salida, 20 μm de alto y 800 μm de ancho (Figura 1). Dichos moldes maestros pueden comprarse a empresas externas o fabricarse en laboratorios académicos (por ejemplo, Gicquel, Y. et ^al.5).
2. Coloque cinta adhesiva alrededor del borde del molde.
   1. Coloque ~ 50 cm de largo, 19 mm de ancho, cinta de oficina transparente estándar (consulte la Tabla de materiales) en un banco, con el lado pegajos....

Results

Para todos los experimentos descritos anteriormente, los filamentos de actina marcados fluorescentemente deben ser claramente visibles, con buen contraste, indicativos de baja fluorescencia de fondo desde la superficie (Figura 4, consulte el Archivo complementario 1 para la solución de problemas comunes). Los filamentos de actina tampoco deben adherirse a la superficie: cuando el caudal dominante es bajo, las fluctuaciones laterales de los filamentos de actina deben ser perc.......

Discussion

En comparación con los métodos estándar de filamento único en los que los filamentos de actina están anclados a la superficie por múltiples puntos a lo largo de su longitud o mantenidos cerca de ella por un agente de apiñamiento como la metilcelulosa, la microfluídica ofrece una serie de ventajas. Como las interacciones con la superficie son mínimas, se evitan las pausas artificiales que estas interacciones pueden inducir durante el alargamiento y la despolimerización. Los filamentos están alineados por el flujo, paralel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Caseína	Merck	C6905	Utilizada a 8 mg/mL
Punzón de biopsia (con émbolo)	Ted Pella	15115-2	ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotina-BSA	Merck	A8549	Usado a 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	Usado a 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack Soporte de teflón	Invitrogen	C14784	para 8 cubreobjetos
cubreobjetos 22x40mm Espesor #1.5	Menzel Glä ser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	componente en f-buffer
DTT	Euromedex	EU0006-D	componente en f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Fluoróforo para el marcaje de actina en Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	Para biotinilar actina en Lys328
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	Detergente para limpieza de vidrios
ImageJ	NIH	N/A	software de código abierto
Laboport	KNF	811kn.18	bomba de vacío (vacío máximo: 240 mbar)
Cinta invisible mágica	Scotch	7100024666	de oficina transparente estándar
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL Tubos de depósito microfluídico
Dispositivo microfluídico Parte 1: Unidad de flujo S	Fluigent	FLU-S-D-PCKB
Dispositivo microfluídico Parte 2: Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	Soporte de depósito
Dispositivo microfluídico Parte 3: MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001 Controlador de	presión
Modelo 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	Limpiador ultravioleta
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO utilizado para marcar actina
neutravidina	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	Uso a 1 mg/mL en PBS.
Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Elastómero de silicio	Dow Corning	1673921	Contiene base y agente de curado PDMS
Tubo de polieteretercetona (PEEK)	Merck	Z226661	" Azul" : Diámetro interno = 0,25 mm
Pistola de soplado de seguridad	Coilhose Pneumatics	700-S	Aire filtrado
Tubo de silicona	VWR	228-0701P	Conectar PEEK al acoplador
Acoplador de catéter de acero inoxidable	Prime Bioscience	SC22/15	Insertado en las entradas y salidas de PDMS para conectar a los tubos de PEEK
Película termoplástica	Sigma Aldrich	PM996	Standard "parafilm"
Etanol ultrapuro	VWR	64-17-5
Baño de limpieza ultrasónico	VWR	USC200TH	Para alojar vasos de precipitados de 1 L
Desecador	de vacío SP Bel-Art F42022-0000		para desgasificar el PDMS o soluciones