Microfresado de control numérico computarizado de un dispositivo acrílico microfluídico con una restricción escalonada para inmunoensayos magnéticos basados en nanopartículas

Summary

La microfluídica es una poderosa herramienta para el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin embargo, a menudo se requieren equipos y materiales costosos, así como técnicas laboriosas de fabricación y manipulación. Aquí, detallamos el protocolo de fabricación de un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos magnéticos basados en micro y nanopartículas en un entorno de bajo costo y fácil de usar.

Abstract

Los sistemas microfluídicos han mejorado enormemente las técnicas de inmunoensayo. Sin embargo, muchas técnicas de microfabricación requieren equipos especializados, costosos o complicados, lo que hace que la fabricación sea costosa e incompatible con la producción en masa, que es una de las condiciones previas más importantes para que las pruebas en el punto de atención (POCT) se adopten en entornos de bajos recursos. Este trabajo describe el proceso de fabricación de un dispositivo de acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para pruebas de inmunoensayo enzimático conjugado con nanopartículas utilizando la técnica de microfresado de control numérico computarizado (CNC). El funcionamiento del dispositivo microfluídico se demuestra mediante la realización de un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra una restricción física escalonada de solo 5 μm de altura, utilizada para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética colocando un imán externo. De esta manera, la fuerza magnética sobre el inmunosoporte de las nanopartículas conjugadas es suficiente para capturarlas y resistir el arrastre de flujo. Este dispositivo microfluídico es particularmente adecuado para la producción en masa de bajo costo sin pérdida de precisión para el rendimiento del inmunoensayo.

Introduction

En los últimos años, la microfluídica ha desempeñado un papel importante en las técnicas de inmunoensayo¹. La tecnología de miniaturización tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con los inmunoensayos tradicionales, como la reducción del consumo de muestras y reactivos, tiempos de incubación más cortos, intercambio eficiente de soluciones y mayor integración y automatización².

Además, los sistemas microfluídicos en inmunoensayos, en asociación con nanopartículas magnéticas como inmunosoporte, reducen considerablemente los tiempos de incubación, logrando una alta sensibilidad de detección debido al aumento de la relación superficie-volumen³. El movimiento browniano de las partículas mejora la cinética de reacción durante la formación del complejo antígeno-anticuerpo ^4,5. Además, las propiedades magnéticas de las nanopartículas proporcionan la versatilidad para ser integradas en diferentes configuraciones de dispositivos microfluídicos, lo que las convierte en un candidato ideal para la señalización y captura de moléculas en sistemas de biodetección miniaturizados en chip⁵. Sin embargo, las fuerzas magnéticas son significativamente más débiles que las fuerzas de arrastre a escala nanométrica debido a la alta relación superficie-volumen⁶. Por lo tanto, la captura de nanopartículas para pasos cruciales de inmunoensayo, como el lavado y la detección, puede ser un desafío, y un imán convencional es insuficiente⁴.

Una forma eficiente de manipular las nanopartículas es el uso de una trampa magnética microfluídica formada por micropartículas de hierro, que se empaquetan en una estructura microfluídica³. Por lo tanto, cuando un imán externo se acerca, se crea una interacción compleja dentro del medio poroso magnetizado entre las fuerzas magnéticas y de flujo. La fuerza magnética que actúa sobre las nanopartículas es lo suficientemente fuerte como para capturarlas y resistir el arrastre de flujo ^3,4,7. Este enfoque requiere técnicas de microfabricación que logren resoluciones del orden de unos pocos micrómetros para generar estructuras micrométricas que retengan las micropartículas.

Las técnicas actuales de microfabricación permiten la fabricación de alta resolución de estructuras desde unas pocas micras hasta cientos de nanómetros⁸. Sin embargo, muchas de estas técnicas requieren equipos especializados, costosos o complicados. Una de las principales dificultades es la necesidad de una sala limpia para la fabricación de moldes, que sigue siendo costosa y requiere mucho tiempo ^8,9. Recientemente, los ingenieros microfluídicos han superado este inconveniente mediante el desarrollo de una variedad de métodos de fabricación alternativos, con varias ventajas, como costos reducidos, tiempos de respuesta más rápidos, materiales y herramientas más baratos y una mayor funcionalidad⁸. De esta manera, el desarrollo de nuevas técnicas de microfabricación trajo métodos de bajo costo, no de sala limpia, que logran resoluciones tan bajas como 10 μm⁸. El modelado se puede utilizar directamente sobre un sustrato sin generar un patrón de moldeo costoso, evitando así un proceso que consume mucho tiempo. Los métodos de fabricación directa incluyen fresado CNC, ablación láser y litografía directa⁸. Todos estos métodos son adecuados para producir canales de alta relación de aspecto en una amplia gama de materiales, independientemente de su dureza⁹, lo que permite geometrías, comportamientos físicos y cualidades nuevas y ventajosas en dispositivos microfluídicos⁸.

El microfresado CNC crea estructuras a microescala utilizando herramientas de corte que eliminan el material a granel de un sustrato y es un método de fabricación eficaz para dispositivos microfluídicos^10,11. La técnica de microfresado puede ser útil en aplicaciones microfluídicas para crear microcanales y características directamente en la superficie de trabajo, ofreciendo una ventaja clave: una pieza de trabajo se puede fabricar en poco tiempo (menos de 30 min), reduciendo significativamente el tiempo de respuesta desde el diseño hasta el prototipo¹². Además, la amplia disponibilidad de accesorios de corte de diferentes materiales, tamaños y formas hace de las fresadoras CNC una herramienta adecuada que ha permitido la fabricación de diferentes características en muchos tipos de materiales desechables de bajo costo¹³.

Entre todos los materiales comúnmente utilizados en micromolienda, los termoplásticos siguen siendo una opción líder debido a sus muchas propiedades favorables y compatibilidad con aplicaciones biológicas^10,14. Los termoplásticos son un sustrato atractivo para los sistemas microfluídicos debido a sus importantes ventajas para el desarrollo de sistemas analíticos desechables de bajo costo⁹. Además, estos materiales son altamente susceptibles a procesos de fabricación de alto volumen, lo que los hace adecuados para la comercialización y la producción en masa. Por estas razones, los termoplásticos como el PMMA han sido considerados materiales confiables y robustos desde los primeros años de la microfluídica¹⁰. Se han descrito diferentes protocolos para fabricar canales cerrados en termoplásticos, como la unión con solventes¹⁵, la unión térmica 16 y la unión de tratamiento superficial ultravioleta (UV) / ozono¹⁷.

En muchos casos, la resolución de posicionamiento alcanzada con las microfresadoras convencionales no es suficiente para algunas aplicaciones microfluídicas que requieren estructuras menores de 10 μm. La micromolienda de gama alta tiene suficiente resolución. Desafortunadamente, debido a los altos precios, su uso está limitado a un puñado de usuarios¹². Anteriormente, nuestro grupo de investigación informó de la fabricación y manipulación de una herramienta de bajo coste que permite mecanizar estructuras de menos de 10 μm, superando la resolución de las fresadoras convencionales¹². El accesorio es una plataforma fabricada mediante impresión 3D con electrónica simple, que contiene tres actuadores piezoeléctricos. La superficie contiene juntas en forma de bisagra que permiten levantarla cuando los elementos piezoeléctricos actúan simultáneamente. El desplazamiento del eje Z se puede controlar con una resolución de 500 nm y una precisión de ±1,5 μm¹².

Este artículo presenta los pasos del proceso de fabricación de un dispositivo acrílico (PMMA) a través de una técnica de microfresado. El diseño del chip consiste en un canal principal de 200 μm de ancho y 200 μm de alto y un canal lateral con las mismas dimensiones para purgar el flujo de los reactivos. En la región central, el canal está interrumpido por una restricción física de solo 5 μm de altura, fabricada con la plataforma piezoeléctrica impresa en 3D hecha por este grupo¹², para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética para nanopartículas colocando un imán externo. Mostramos el funcionamiento del dispositivo microfluídico realizando un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que lo hacen único⁴: el uso de nanopartículas magnéticas como soporte inmunológico reduce el tiempo total de prueba de horas a minutos; el uso de una enzima fluorogénica para la detección permite límites de detección que son comparables a los de los ensayos estándar de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA); y el uso de un termoplástico como material de fabricación lo hace compatible con la producción en masa, lo que no fue el caso de las trampas magnéticas de nanopartículas microfluídicas^{anteriores 3}, y lo convierte en un excelente candidato para desarrollar POCT.

Protocol

1. Micromolienda

1. Rectificado de superficies
   1. Encienda la microfresadora y el controlador piezoeléctrico. Inicie su respectivo software de control¹².
   2. Seleccione las brocas de fresado final requeridas (diámetros de 200 μm y 800 μm). Colóquelos en el compartimento apropiado de la fresadora (Figura 1).
   3. Corte rectángulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espesor con la broca final de 800 μm. Fije uno de estos rectángulos cuidadosamente con cinta adhesiva de doble cara a la plataforma piezoeléctrica (Figura 2).
      NOTA: Asegúrese de colocar siempre el rectángulo acrílico en la misma posición para que una de las esquinas coincida con las coordenadas de origen en los ejes x e y para el mecanizado.
   4. Conecte y coloque el sensor z en la superficie del rectángulo de PMMA. Seleccione el pin de detección y muévalo sobre la superficie del sensor. Baje el pin manualmente sin entrar en contacto con el sensor. Active el modo de detección Z0 (Figura 3).
   5. Seleccione la broca de fresado final de 200 μm y muévala al origen x, y. Retire el sensor z. Baje la broca con cuidado sin entrar en contacto con la superficie acrílica.
   6. Gire la broca final de 200 μm a 14.500 rpm. Baje lentamente hasta la coordenada de origen en el eje z (z = 0). Restablezca el eje z 30 μm por debajo del origen. Establezca esta coordenada como el nuevo origen z.
      NOTA: Nunca baje el bit si no está girando. De lo contrario, corre el riesgo de romperse.
   7. Haga clic en el botón Cortar en el software de la microfresadora para activar el panel Cortar. Haga clic en el botón Agregar y seleccione el archivo .txt (Archivo de codificación suplementario 1) con un código creado previamente para la molienda de la superficie acrílica. Haga clic en el botón Salida para iniciar el proceso.
   8. Lleve la broca de extremo a la coordenada donde se mecanizará la restricción. Evite que la broca de extremo se levante de la superficie del suelo una vez que se alcanza esta coordenada haciendo clic en el botón Pausa . De lo contrario, vuelva a colocar manualmente la broca de extremo en esta coordenada (Figura 4A).
2. Fresado de la restricción de 5 μm
   1. Ajuste la velocidad de rotación de la broca final a 11.000 rpm. Elevar la plataforma 6,5 μm con la interfaz de la plataforma piezoeléctrica (Figura suplementaria S1). Mueva la broca final a lo largo del eje y 500 μm. Devuelva la plataforma piezoeléctrica a su valor inicial en el eje z con la interfaz de control.
3. Fresado de microcanales
   1. Abra el archivo de diseño creado anteriormente desde el software de diseño (Archivo de diseño complementario 1). Haga clic en el botón Imprimir . Acceda al menú Propiedades y haga clic en la ventana de color correspondiente a la capa que contiene el diseño a mecanizar. Defina los parámetros de fabricación en el panel Herramientas como se especifica en la figura suplementaria S2.
   2. Desactive las capas no deseadas seleccionando la opción Ninguna en el menú desplegable Herramientas .
4. Fresado de agujeros
   1. Cambie a la broca de extremo de 800 μm. Active la capa de diseño de los orificios de 1,2 mm de diámetro haciendo clic en la ventana de color correspondiente.
   2. Repita el paso 1.3.2., pero en este caso, defina los parámetros de fabricación correspondientes como se describe en la figura suplementaria S3A para los orificios.
      NOTA: La profundidad de los orificios mecanizados es la mitad del espesor acrílico.
   3. Mecanizar dos orificios adicionales en las esquinas contralaterales del rectángulo para la alineación del acrílico de manera invertida en una nueva plataforma (Figura 4B). Despegue el rectángulo acrílico de la plataforma piezoeléctrica. Voltea el acrílico y pégalo con cinta adhesiva de doble cara sobre el adaptador con los pilares mecanizados (Figura 4C, D).
   4. Abra el archivo con el diseño de los orificios para la cara opuesta del software de diseño (Archivo de diseño complementario 2). Establezca los parámetros de fabricación correspondientes como se describe en la figura suplementaria S3B. Fresar la mitad restante de los orificios de entrada y salida del reactivo con un diámetro de 1,5 mm y una profundidad de 0,7 mm (Figura suplementaria S3C).

Figura 1: Colocación de la broca final. (A) Las brocas de la fresa final de 200 μm y 800 μm se colocan y fijan mediante un tornillo al soporte de acero. (B) Cada broca de extremo se coloca en el compartimento específico de la microfresadora para su selección automática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Plataforma piezoeléctrica. La plataforma está fabricada mediante impresión 3D y consta de dos bases hexagonales unidas por bisagras que permiten un desplazamiento fino en el eje z controlado por tres actuadores piezoeléctricos. También se observa un adaptador de acrílico, en el que se adjunta el rectángulo de PMMA, y que permite ajustar la esquina de alineación de las coordenadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Calibración del eje Z. Se detallan los pasos de la calibración del eje z. (A) El sensor z incluye un cable que se conecta a la microfresadora. (B) El sensor se coloca directamente sobre la superficie a mecanizar. (C) El pasador de detección consiste en una barra de metal colocada en un compartimento especial junto a las brocas de la fresadora final. (D) Cuando ambos accesorios entran en contacto, la microfresadora calcula automáticamente la coordenada de origen en el eje z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Superficie acrílica rectificada . (A) La broca de extremo de 200 μm de diámetro barre toda la superficie del rectángulo acrílico, eliminando una capa de aproximadamente 30 μm de altura. (B) La imagen muestra las diferentes estructuras fresadas en la cara del acrílico previamente rectificado. Se observan canales y orificios para la entrada y salida del reactivo. La restricción de 5 μm no se puede ver a simple vista. (C) Superficie microfresada con orificios de alineación y adaptador con pilares de alineación en esquinas opuestas. (D) El acrílico está alineado boca abajo en el adaptador con pilares, en los que encajan los orificios de alineación. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Sellado del canal

1. Limpieza acrílica
   1. Retire el rectángulo acrílico de la plataforma adaptadora del pilar. Tome otro rectángulo de acrílico sin mecanizar. Lave ambas láminas de acrílico con alcohol isopropílico (IPA) y enjuague con agua destilada. Use guantes y evite el contacto con IPA.
   2. Sumerja el acrílico en un baño ultrasónico durante 10 minutos (Figura 5A, B).
2. Exposición al cloroformo gaseoso
   1. Secar ambas láminas de acrílico perfectamente. Pegue con cinta adhesiva al interior de una tapa de placa de Petri de vidrio con cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de colocar el lado del canal mecanizado expuesto (Figura 5C). Use guantes y evite tocar la superficie acrílica directamente.
   2. Coloque la base de la placa de Petri de vidrio dentro de una placa de Petri de vidrio más grande (Figura 5D). Vierta 1 ml de cloroformo en la base de la placa de Petri. Coloque rápidamente la tapa con las láminas de acrílico unidas al lado interior.
   3. Agregue inmediatamente agua destilada a la base de la placa de Petri más grande hasta el nivel de la tapa de la placa de Petri. Permitir la exposición del acrílico al gas cloroformo durante 1 min (Figura 5E).
      NOTA: Tenga en cuenta que un tiempo de exposición más largo al cloroformo atacará la superficie acrílica, y la restricción de 5 μm se derretirá, modificando su altura, o desaparecerá por completo.
   4. Incline la placa de Petri para romper el sello de agua creado. Retire inmediatamente el acrílico del cloroformo descubriendo la placa de Petri. Tenga cuidado de no derramar el agua.
      PRECAUCIÓN: Haga este proceso en la campana extractora y use guantes ya que el cloroformo es altamente tóxico.
3. Adhesión por prensado y calentamiento
   1. Despegue ambas placas de acrílico de la cinta de doble cara.
   2. Alinee ambos acrílicos con los lados que fueron expuestos al cloroformo gaseoso cara a cara, formando un sándwich. Colocar los acrílicos en la prensa a 18 kgf/^cm2 y a una temperatura de 90 °C (Figura 5F,G).
      NOTA: Se recomienda colocar el acrílico alineado longitudinalmente y cambiar su alineación después de 2 min para un mejor sellado. Si, después de este tiempo, el sello es insuficiente, vuelva a colocarlo en la prensa por intervalos de no más de 1 minuto. Usando el estereoscopio, verifique el estado de los canales y la restricción. Tenga en cuenta que, en caso de exceder el tiempo de prensado, existe el riesgo de eliminar la restricción.
4. Accesorio de manguera
   1. Corte longitudes de manguera de 2-3 cm. Haz un corte completamente recto. Conecte cada manguera a los orificios del dispositivo con adhesivo líquido de secado instantáneo (Figura 6A). Evite que el adhesivo entre en el chip.

Figura 5: Proceso de sellado del dispositivo. (A) Cada una de las láminas de acrílico se coloca en una bolsa resellable con agua destilada y se sumerge en el baño ultrasónico. (B) La imagen de la izquierda muestra los canales justo después de la fabricación, y la imagen de la derecha muestra el mismo dispositivo después del lavado con IPA y el baño ultrasónico, que elimina todas las impurezas y residuos acrílicos del microcanal. Se observan los bordes de la restricción que interrumpe el canal central de 200 μm, lo que confirma el exitoso proceso de fresado. Barras de escala = 500 μm. (C) Ambos acrílicos se secan y se adhieren a la plataforma de vidrio en la tapa. (D) La base de la placa de Petri se coloca dentro de otra placa de mayor diámetro. (E) Al cerrar la placa de Petri, el sello de agua evita que el cloroformo gaseoso se escape. (F) Descripción de los elementos de la palanca con un peso de 5 kg. (G) Imagen de la palanca abierta, mostrando en rojo la zona donde se coloca el acrílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación del dispositivo

1. Llene los canales con agua destilada usando una jeringa. Asegúrese de que no haya fugas o resistencia al flujo. Sumerja el dispositivo en un baño ultrasónico durante 10 minutos para eliminar cualquier resto de acrílico, adhesivo o material no deseado dentro de los canales.
2. Vacíe el agua dentro de los canales del dispositivo. Utilice una jeringa para introducir una solución bloqueante preparada con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (p/v) diluida en solución salina tamponada con Tris (TBS) y previamente filtrada a través de un filtro de jeringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
3. Preparar una suspensión de micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro en BSA al 5%.
   NOTA: Las micropartículas son previamente funcionalizadas con una capa de sílice-polietilenglicol (PEG) que confiere resistencia a la absorción de proteínas⁴.
4. Incubar el chip y la suspensión de micropartículas con la solución de bloqueo durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Si es posible, dejar bloquear durante la noche a 4 °C.

4. Formación de trampas de micropartículas

1. Inserte las micropartículas en el chip con una aguja de jeringa a través de la manguera de salida del canal lateral. Coloque el chip verticalmente y permita que las micropartículas fluyan bajo el efecto de la gravedad a través del canal lateral. Gire el chip 180° en dos pasos de 90° y permita que las micropartículas se dirijan y compacten a la restricción de 5 μm.
2. Elimine el exceso de micropartículas girando por gravedad 45° hacia el canal lateral.
3. Mantenga el dispositivo en posición vertical para evitar deshacer la trampa de micropartículas. Consulte la Figura 6B para obtener un resumen del proceso de formación de trampas de micropartículas.

5. Inmunoensayo

1. Preparación de nanopartículas
   1. Tomar 2 μL de la suspensión de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas con lisozima (modelo de antígeno). Añádalo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 100 μL de solución de bloqueo. Incubar durante la noche a 4 °C.
   2. Añadir 150 μL de tampón de lavado (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Coloque el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un separador magnético. Mantener durante 15 min para permitir la separación de las nanopartículas (Figura Suplementaria S4).
      NOTA: El volumen mínimo para el separador magnético es de 200 μL. Evite usar un volumen más pequeño.
   4. Retire el líquido del tubo con una micropipeta. Evite el contacto con la pared del tubo donde se formó el pellet de nanopartículas.
   5. Añadir 250 μL de tampón de lavado fresco. Mantenga el tubo bajo agitación durante 15 min.
   6. Repita los pasos 5.1.3.-5.1.5. 2 veces más, agitando solo durante 5 min.
   7. Agregue la concentración deseada de anticuerpo antilisozima primario (consulte la Tabla de materiales). Ajustar a un volumen final de 100 μL en diluyente de anticuerpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubar durante 15 min a 37 °C. Siga agitando durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente.
   9. Repita los pasos de lavado 5.1.2.-5.1.6.
   10. Añadir 100 μL de diluyente de anticuerpos. Añadir el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP-AbII) (véase la Tabla de materiales) con una dilución de 1:500.
   11. Repita los pasos de lavado 5.1.2.-5.1.6.
   12. Mantener las nanopartículas en un volumen final de 50 μL de diluyente de anticuerpos.

6. Montaje experimental

1. Llene las dos jeringas de vidrio de 100 μL con agua, conecte una manguera de 6,5 cm de largo a cada jeringa, inserte un alfiler de metal en el extremo de la manguera y coloque ambas jeringas en la bomba de jeringa controlada por computadora.
2. Selle todas las mangueras del dispositivo acrílico con calor.
3. Corte la manguera de entrada y manténgala solo unos pocos milímetros. Llene la aguja dispensadora con un tampón de lavado e insértela en la manguera de corte. Deje que la solución gotee antes de conectar la aguja al dispositivo para evitar el acceso de aire al dispositivo.
4. Corte la manguera de salida del canal lateral. Conéctelo a la bomba de la jeringa. A continuación, realice el mismo procedimiento para la manguera de salida del canal principal.
   NOTA: Es clave realizar los pasos 6.3.-6.4. en este orden para evitar desempaquetar la trampa de micropartículas. Si es posible, verifique el estado de la trampa durante estos pasos con la ayuda de una lupa.
5. Coloque un portaobjetos de vidrio en la plataforma del microscopio. Fije el imán a la diapositiva con cinta adhesiva de doble cara y coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva en cada lado para fijar los bordes del chip al vidrio.
6. Ajuste un caudal de 50 μL/h a través de las pestañas Caudal y Unidades del controlador de la bomba de jeringa. Seleccione el modo de retirada y haga clic en el botón Inicio para activar el flujo del búfer de lavado.
7. Con cuidado, acerque el dispositivo hacia la diapositiva con el imán de manera horizontal para que el área del chip que contiene la trampa entre en contacto con el imán.
8. Pegue los bordes del dispositivo al vidrio con cinta adhesiva de doble cara para evitar el movimiento. Evite obstruir la trayectoria óptica para la microscopía (Figura 6C).

Figura 6: Configuración final del dispositivo . (A) Dispositivo de acrílico con las mangueras conectadas a las entradas y salidas correspondientes. La escala muestra las dimensiones del dispositivo en centímetros. (B) Protocolo para la formación de la trampa de micropartículas. Las micropartículas fluyen a través del canal por gravedad cuando el dispositivo se coloca en posición vertical. Las micropartículas se concentran en la restricción de 5 μm. El exceso de micropartículas se elimina fácilmente girando el chip a través del canal lateral. El chip se mantiene vertical para preservar la trampa antes del inmunoensayo. (C) Dispositivo microfluídico montado en un portaobjetos de vidrio que contiene el imán, en la etapa del microscopio de fluorescencia invertida. Se observa la aguja dispensadora a través de la cual se agregan los reactivos, así como las mangueras de salida que se conectan a una bomba de jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Inmunodetección

1. Mantenga el tampón de lavado fluyendo durante 10 min a 50 μL/h para eliminar el exceso de BSA.
2. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta. Añadir 50 μL de la suspensión de nanopartículas.
3. Hacer fluir la suspensión de nanopartículas durante 7 min a un caudal de 100 μL/h. Posteriormente, cambie el caudal a 50 μL / h y el flujo durante otros 15 minutos.
4. Cambie la aguja dispensadora. Hacer fluir el tampón de lavado durante 10 min a 50 μL/h. Prepare el sustrato fluorogénico de acuerdo con las especificaciones del fabricante durante el paso de lavado.
5. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta. Añadir 100 μL del sustrato fluorogénico (ver la Tabla de materiales). Hacer fluir el sustrato fluorogénico durante 6 min a 50 μL/h.
6. Ajuste los parámetros de medición del caudal (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h y 10 μL/h ) y el tiempo (6 min) en las pestañas correspondientes Caudal y Ajustar temporizador de la interfaz que controlan la bomba de jeringa. Asegúrese de seleccionar el modo de retirada para cada una de las mediciones que se realizarán.
7. Establezca una pestaña de caudal adicional a 50 μL/h y ajuste el temporizador a 3 min para el paso de lavado.
8. Encienda la fluorescencia del microscopio 15 s antes de que el sustrato a 50 μL/h se detenga. Inicie la captura de imágenes con el software de la cámara del microscopio 10 s antes de que el sustrato se detenga con un tiempo de exposición de 1.000 milisegundos. Realice imágenes durante 6 minutos a 1 fotograma/s (FPS).
9. Haga clic en el botón Inicio del parámetro de caudal deseado inmediatamente después de que se detenga el caudal de lavado del sustrato a 50 μL/h. Haga clic en el botón Inicio del flujo de lavado (50 μL/h) inmediatamente después de que se detenga el flujo de medición seleccionado.
10. Detenga la captura de imágenes y apague la fluorescencia del microscopio para evitar el fotoblanqueo del sustrato.
11. Repita los pasos 7.8.-7.10. para cada caudal de medición utilizado.

Results

Se logró establecer un protocolo de fabricación altamente reproducible que mejora la resolución de la técnica convencional de micromolienda. Usando este protocolo, se logra la fabricación de un canal tan pequeño como 5 μm de altura que opera como una restricción escalonada en un canal de 200 μm de altura. El diseño simple de la restricción escalonada captura micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro que, cuando se compactan en el microcanal, permiten la creación de una trampa magnética cuando un imán externo se ace...

Discussion

Se fabricó un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos utilizando nanopartículas como inmunosoporte utilizando una técnica de micromolienda. El método de fabricación directa sobre el sustrato tiene la ventaja de evitar el uso de un molde maestro y el tiempo y costes que ello implica. Sin embargo, se limita a la creación rápida de prototipos y la fabricación de dispositivos de alto volumen.

Aquí, utilizamos una plataforma piezoeléctrica accesoria previamente informada para la fresa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Fresa	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Fresa	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Micropartículas de carbonilo-hierro	Sigma-Aldrich	44890	7 μ m
Cloroformo	Fermont	6201	Peligro para la salud: Moderado Inflamabilidad: Ninguno Reactividad: Ninguna Peligro de contacto: Moderado
Cámara CMOS Moment	Teledyne Photometrics		Tecnología de sensor: CMOS Eficiencia cuántica: 73% Tamaño de píxel: 4.5 y micro; m x 4.5 y micro; m Interfaces compatibles: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		para diseñar y crear la trayectoria de grabado en la superficie
Campana de extracción	Desconocido	Desconocido
de plástico flexible	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Microsope de fluorescencia	ZEISS	Axio Vert.A1
Aguja dispensadora de alta precisión	Loctite	98612
Aplicación de controlador piezoeléctrico casero	LabView		Consulte la referencia 12 para obtener más detalles.
Loctite 495 adhesivo instantáneo	Henkel	49503	Aplicar con punta de micropipeta o aguja dosificadora
MagJET Rack	de separación termocientífico		12 x 1,5 mL
Prensa mecánica	Fresadora
	Roland	MDX-50
Plataforma piezoeléctrica	Hecho en		Ver referencia 12
Polimetilmetacrilato - Lámina - PMMA, Acrílico	Goodfellow	ME303018/1	Espesor: 1,3 mm, Transparencia: Claro/Transparente
PVCamSoftware de prueba	Teledyne Photometrics	Versión 3.10.107	Software de adquisición de imágenes
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Bomba de jeringa	kd Scientific	KDS200	Puede contener hasta dos jeringas
Baño Utrasonic	Branson	2800
VPanel software	Sistema operativo Windows	versión 1.0.3.0	Software para el control de la microfresadora