Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.
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Artículo de método
Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)
En este artículo
Resumen
Resumen
El protocolo actual describe el uso de partículas lentivirales para la entrega de ARN de horquilla corta (shRNA) tanto a células madre embrionarias humanas (hESC) como a células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hESCs de alta eficiencia. Las partículas lentivirales se generaron mediante la co-transfección de células HEK293T utilizando vectores de entrada (portadores de shRNAs) junto con plásmidos de empaquetamiento (pAX y pMD2.G) utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilinimina (PEI). Las partículas virales se concentraron mediante ultracentrifugación, lo que dio lugar a títulos medios superiores a 5 x 107. Tanto las hESC como las NPC podrían infectarse a altas eficiencias utilizando estas partículas lentivirales, como lo demuestra la selección de puromicina y la expresión estable en las hESC, así como la expresión transitoria de GFP en las NPC. Además, el análisis de Western Blot mostró una reducción significativa en la expresión de genes dirigidos por shRNAs. Además, las células conservaron su pluripotencia, así como su potencial de diferenciación, como lo demuestra su posterior diferenciación en diferentes linajes del SNC. El protocolo actual se ocupa de la entrega de shRNAs; sin embargo, el mismo enfoque podría utilizarse para la expresión ectópica de los ADNc para los estudios de sobreexpresión.
Introducción
Las células madre embrionarias humanas (hESCs) derivadas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de factores externos en condiciones in vitro 1,2. Con el fin de aprovechar plenamente el potencial de las hESC, es imperativo contar con métodos de administración de genes rápidos y confiables para estas células. Convencionalmente, las técnicas utilizadas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: sistemas de administración de genes no virales y virales 3,4. Los sistemas de administración de genes no virales más utilizados son la lipofección, la electroporación y la nucleofección. Los sistemas de administración no viral son ventajosos debido a la menor cantidad de mutaciones de inserción y una disminución general de la inmunogenicidad 5,6. Sin embargo, estos métodos dan como resultado una baja eficiencia de transfección y una corta duración de la expresión génica transitoria, lo que es una limitación importante para los estudios de diferenciación a largo plazo7. La electroporación da como resultado mejores eficiencias de transfección en comparación con la lipofección; sin embargo, resulta en más del 50% de muerte celular 8,9,10. Utilizando la nucleofection, la supervivencia celular y la eficiencia de la transfección se pueden mejorar combinando lipofección y electroporación, pero el enfoque necesita tampones específicos de la célula y equipos especializados y, por lo tanto, se vuelve bastante costoso para aplicaciones ampliadas11,12.
Por el contrario, los vectores virales han mostrado una mejora en la eficiencia de la transfección, así como una baja citotoxicidad general, después de la transducción. Además, los genes entregados se expresan de manera estable y, por lo tanto, hacen que este método sea ideal para estudios a largo plazo13. Entre los vectores virales más utilizados para la entrega de genes en hESCs se encuentran los vectores lentivirales (LVS), que pueden dar más del 80% de eficiencia de transducción utilizando partículas virales de alto título14,15. La lipofección y la precipitación de CaPO4 se encuentran entre los métodos más utilizados para transfectar transitoriamente las células HEK293T o sus derivados con vectores de transferencia de genes junto con plásmidos de empaquetamiento para producir partículas lentivirales16. Aunque la lipofección da como resultado una buena eficiencia de transfección y una baja citotoxicidad, la técnica se ve obstaculizada por su costo, y la ampliación para obtener partículas lentivirales de alto título sería muy costosa. La precipitación de CaPO4 da como resultado eficiencias de transfección relativamente similares a las obtenidas mediante lipofección. Aunque rentable, la precipitación de CaPO4 resulta en una muerte celular significativa después de las transfecciones, lo que dificulta la estandarización y evitar variaciones de lote a lote17. En este escenario, el desarrollo de un método que brinde una alta eficiencia de transfección, baja citotoxicidad y rentabilidad es crucial para la producción de partículas lentivirales de alto título que se utilizarán en hESC.
La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico que puede transfectar células HEK293T a alta eficiencia sin mucha citotoxicidad y tiene un costo insignificante en comparación con los métodos basados en lipofección18. En esta situación, pei se puede utilizar para aplicaciones ampliadas de producción de LVS de alto título a través de la concentración de partículas lentivirales de sobrenadantes de cultivo utilizando diversas técnicas. El artículo presentado describe el uso de PEI para transfectar células HEK293T y la concentración de vectores lentivirales utilizando ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa. Usando este método, obtenemos regularmente títulos muy por encima de 5 x 107 UI / ml con bajas variaciones de lote a lote. El método es simple, directo y rentable para aplicaciones ampliadas para la entrega de genes a células derivadas de hESCs y hESCs.
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Protocolo
1. Transfección de células HEK293T utilizando el reactivo PEI o Lipofectamine 3000
- Cultivo de células HEK293T en DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% co2 y 21% O2 hasta que sean 90% confluentes antes de la siembra para transfección. Utilice un número relativamente bajo de células de paso para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P30).
- Sembrar 4 x 106 células en 10 mL de medio de crecimiento completo en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y crecer durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
- Para cada transfección, diluya el ADN plásmido (1 mg/ml de existencias) en 1 ml de medios DMEM libres de suero en tubos centrífugos de 1,5 ml utilizando la siguiente proporción de plásmidos de entrada y envasado:
Vector de entrada = 10 μg
psPAX2.0 = 7.5 μg
pMD2.G = 5 μg - Vórtice durante 10 s y gire el tubo a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para recogerlo.
- Agregue 70 μL de PEI (solución madre de 1 mg / ml) al tubo, y vórtice y espín brevemente como se describió anteriormente para recolectar. El volumen de PEI utilizado se basa en una relación de 1:3 de ADN total (μg):P EI (μg).
- Para la transfección a base de lipofectamina, diluya los vectores anteriores en 500 μL de medios DMEM sin suero que contengan 45 μL de reactivo P suministrado en el kit e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
- Diluir 70 μL de reactivo L suministrado en el kit utilizando 500 μL de medios DMEM sin suero e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Combine el contenido de ambos tubos e incube los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la formación compleja.
- Añadir gota a gota 1 ml de ADN/PEI o 1 ml de complejos de ADN/lipofectamina a la placa que contiene células e incubar durante 6 h a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
- Después de 6 h, cambie a medios de crecimiento completos frescos (10 ml) y devuelva las células a la incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
2. Recolección de LVS y ultracentrifugación
- Después de 2 días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y superponga las células nuevamente con 10 ml de medios de crecimiento completos frescos.
- Después de 3 días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y combínelos con los medios que contienen el virus recolectados en el punto de tiempo de 2 días.
- Centrifugar el sobrenadante viral a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C para granular los desechos celulares.
- Filtre el sobrenadante utilizando un filtro de baja unión a proteínas de tamaño de poro de 0,45 μm (ya sea PES o SFCA) y guárdelo a 4 °C hasta que esté listo para la ultracentrifugación. El sobrenadante filtrado que contiene partículas lentivirales puede almacenarse a 4 °C durante 5 días sin una pérdida significativa de títulos virales.
- Esterilizar los tubos de la ultracentrífuga que contienen las tazas lavándolas con etanol al 70% durante 10 min, secar al aire, cerrar y mantener a 4 °C.
- Agregue 36 ml de medios filtrados que contengan partículas lentivirales a un tubo de ultracentrífuga estéril.
- Llene 5 ml de una stripette estéril con 4 ml de solución estéril de sacarosa al 20% (preparada en PBS) y dispense directamente en el fondo del tubo de ultracentrífuga (CU) que contiene LVS. Es importante que la solución de sacarosa no se mezcle con el medio y haga un gradiente en la parte inferior del tubo.
- Equilibre todos los tubos de la ultracentrífuga utilizando medios DMEM sin suero, colóquelos en las tazas frías de retención del tubo de la ultracentrífuga y cierre las tapas.
- Girar los tubos a 125.000 x g durante 2 h a 4 °C.
- Después del centrifugado, deseche cuidadosamente el sobrenadante invirtiendo el contenido del tubo en un recipiente que contenga lejía sin molestar el pellet. Marque el pellet si es visible.
- Coloque el tubo de la ultracentrífuga en un tubo estéril de 50 ml y agregue 200 μL de DPBS estéril exactamente en la parte superior del pellet. Mantener a 4 °C durante la noche sin ser molestado.
- Al día siguiente, mezcle suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo 40x.
- Gire brevemente a 13,000 x g en una centrífuga de mesa para peletizar cualquier residuo.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y alícue la preparación del virus como alícuotas de 20 μL. Conservar a -80 °C.
- Reservar 5 μL de la preparación para las mediciones del título viral.
3. Medición del título LVS para vectores basados en pLKO.1
- Determine el título de partículas lentivirales mediante el uso de una qPCR siguiendo las recomendaciones del fabricante.
- Para una curva estándar, prepare cinco diluciones en serie de 10 veces de ADN de control estándar (proporcionadas en el kit) diluyendo 5 μL de ADN en 45 μL de H2O libre de nucleasa en cada paso. Utilice diluciones de 1:100 a 1:100.000 para generar una curva estándar.
- Configure las reacciones en hielo por duplicado de la siguiente manera:
2x mezcla maestra qPCR 10 μL
Mezcla de imprimación 2 μL
Muestra o ADN estándar 2 μL
Libre de nucleasas H2O 6 μL - Realizar qPCR utilizando las condiciones de ciclismo mencionadas en el manual del kit durante un total de 35 ciclos.
- Trazar valores de umbral de ciclo (Ct) en el título del eje Y frente al de virus en el eje X.
- Genere una regresión logarítmica utilizando cuatro diluciones de ADN de control estándar (1:100 a 1:100.000) para determinar el título de muestra de virus desconocido utilizando una ecuación de línea de tendencia.
4. Medición del título LVS para vectores basados en pll3.7
- Sembrar 1 x 105 células HEK293T en cada pocillo de una placa de pocillo P12 en 1 mL de medios de crecimiento completos 24 h antes de las infecciones.
- Suplementar el medio con 8 μg/ml de polibreno y añadir 1 ml en cada tubo estéril de 1,5 ml.
- Diluya las partículas virales utilizando 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL y 0,1 μL de partículas lentivirales concentradas en cada uno de los 1 ml de medios que contienen polibreno.
- Reemplace los medios de las células HEK293T con los medios que contienen las cantidades indicadas de partículas lentivirales junto con 8 μg / ml de polibreno e incube durante 24 h a 37 ° C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
- Al día siguiente, cambie a medios frescos y continúe el cultivo durante 72 h a 37 ° C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
- Después de 72 h, lave las células con PBS, tripsinize a 37 °C de acuerdo con el protocolo del fabricante y resuspenda en 1 ml de PBS.
- Realice la clasificación de celdas FACS utilizando un clasificador de celdas, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Establezca la puerta al 0% de células GFP positivas utilizando células HEK293T no infectadas y cuente 50,000 eventos para cada muestra para determinar el porcentaje de células positivas para cada dilución viral.
- Utilice solo los volúmenes de partículas lentivirales que dan %GFP células positivas en el rango de 2% -20% para calcular el título de partículas lentivirales.
5. Infección de hESCs y selección estable
- Lave las células con 2 ml de PBS que crecen en cada pocillo de una placa multipocillo de cultivo celular de 6 pocillos.
- Separe las células de la placa de cultivo celular utilizando 1 ml de reactivo de disociación celular 1x mediante incubación a 37 °C durante 5 min.
- Recoger las células en medios DMEM/F12 y centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente para recoger el pellet celular.
- Aspirar, resuspendir las células en 1 ml y contar con un hemocitómetro.
- Haga una suspensión celular con 2 x 105 células/ml de medios de crecimiento completos que contengan mTeSR1 suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico de 10 ng/ml (bFGF), penicilina/estreptomicina (P/S) e inhibidor de ROCK (RI) de 10 μM.
- Sembrar 1 x 105 células en placas de pozos P24 diluidas completas de membrana basal diluidas en 500 μL de medios de crecimiento completos y cultivar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 y 21% de O2.
- Al día siguiente, infectar hESCs a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 con 8 μg/mL de polibreno e incubar a 37 °C durante 8 h.
- Después de 8 h, reemplace los medios que contienen el virus con medios de crecimiento frescos (-RI) y continúe el cultivo hasta que las células sean 90% confluentes.
- Comience la selección de puromicina (0,8 μg/ml) cuando las células alcancen el 90% de confluencia, que suele ser de 48-72 h después de la infección.
- Después de que se complete la selección (generalmente 4-6 días), divida las células estables (1: 4) y expanda las células para la criopreservación y el análisis posterior.
6. Transducción de células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC)
NOTA: Los NPC se derivaron de células H9 utilizando un protocolo de inhibición de doble Smad, como se describió anteriormente19.
- Brevemente, trate las células H9 con reactivo de disociación celular a 37 °C durante 5 min para generar células individuales y resuspend en medios de crecimiento completos que contengan mTeSR1 suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) de 10 ng/mL, penicilina/estreptomicina (P/S) e inhibidor de ROCK (RI) de 10 μM. Semilla en platos de cultivo celular de 6 pocillos diluidos recubiertos de Matrigel a una densidad de 60.000 células/cm2 (día 0).
- Iniciar la diferenciación cuando las células alcanzan una confluencia del 95% -100% cambiando a medios 100% KSR que contienen LDN193189 (200 nM) y SB431542 (10 μM) (día 1).
- El día 2, cambie los medios nuevamente con 100% KSR suplementado con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) y XAV939 (5 μM).
- En el día 4 de diferenciación, cambie a una mezcla de medio KSR (75%) y medio N2 (25%) con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) y XAV939 (5 μM).
- Del día 6 al día 12, cambie gradualmente los medios al 100% N2 suplementado con LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) y XAV939 (5 μM) aumentando el medio N2 un 25% cada día y cambiando los medios después de cada 2 días.
- Día de cultivo 12 NPCs en medios N2:B27 suplementados con 20 ng/mL bFGF.
- Sembrar 2 x 105 células en cada pocillo de una placa P6 diluida de membrana basal completa diluida en 2 mL de medios de cultivo de NPCs e incubar para permitir que las células se adhieran.
- Al día siguiente, infectar las células con partículas lentivirales a un MOI 6 en presencia de 8 μg/ml de polibreno.
- Después de 8 h, reemplace los medios que contienen virus con medios de crecimiento de NPC frescos.
- Al día siguiente, repite las infecciones y cambia los medios a las 8 h.
- Mantenga las células en cultivo durante 72 h antes de cosecharlas para su posterior análisis.
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Resultados
Después de la transferencia de genes, inevitablemente se requiere una alta viabilidad de hESCs. A pesar de los esfuerzos y la optimización de los protocolos para reducir la muerte celular después de la electroporación de hESCs, más del 50% de la muerte celular todavía se observa después de la electroporación de estas células, junto con la baja eficiencia de transfección20. La transferencia de genes mediada por lentivirales no solo resulta en una alta eficiencia de transferencia de genes, sino que ...
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Discusión
La capacidad de modificar genéticamente las células madre con fines de estudio o clínicos está limitada tanto por la tecnología como por la comprensión básica de la biología de las hESC. Las técnicas que han mostrado un potencial significativo en las ESC de ratón, como la lipofección y la electroporación, no son altamente eficientes para las hESC, que son notoriamente difíciles para la administración de genes por métodos convencionales20. Esta noción ha llevado no solo a la optimización de las téc...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Universidad de los Emiratos Árabes Unidos (UAEU), la subvención # 31R170 (Centro Zayed de Ciencias de la Salud) y # 12R010 (beca UAEU-AUA). Agradecemos al profesor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) por ayudarnos a editar el manuscrito por estilo y gramática.
Todos los datos están disponibles bajo petición.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38,5 mL, Estéril + Libre Certificado Tubos Ultra Transparentes de Pared Delgada Abierta | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Albúmina sérica bovina FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Matriz de membrana basal Corning Matrigel sin LDEV Tecnologías de | Corning | 354234 | |
| ciclopamina | 72074 | ||
| Medios DMEM | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Mezcla de nutrientes F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS sin: Ca y Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Suero fetal bovie | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Anticuerpo mAb de conejo | CST | 2118S | |
| Reactivo de disociación celular suave | Tecnologías de células madre | 7174 | |
| HyClone Aminoácidos no esenciales (NEAA) Solución 100X | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L de glutamina, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Anticuerpo policlonal | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 medios completos | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Medio neurobasal 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Suplemento 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Suplemento 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicilina estreptomicina SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 Vector TRC | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Reactivo para infecciones por polibreno | Sigma | TR1003- G | |
| Polietilenimina, ramificada | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | ||
| Inhibidor de ROCK Y-27632 diclorhidrato | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Tripsina .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Referencias
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