Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

Resumen

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Resumen

El protocolo actual describe el uso de partículas lentivirales para la entrega de ARN de horquilla corta (shRNA) tanto a células madre embrionarias humanas (hESC) como a células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hESCs de alta eficiencia. Las partículas lentivirales se generaron mediante la co-transfección de células HEK293T utilizando vectores de entrada (portadores de shRNAs) junto con plásmidos de empaquetamiento (pAX y pMD2.G) utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilinimina (PEI). Las partículas virales se concentraron mediante ultracentrifugación, lo que dio lugar a títulos medios superiores a 5 x 10⁷. Tanto las hESC como las NPC podrían infectarse a altas eficiencias utilizando estas partículas lentivirales, como lo demuestra la selección de puromicina y la expresión estable en las hESC, así como la expresión transitoria de GFP en las NPC. Además, el análisis de Western Blot mostró una reducción significativa en la expresión de genes dirigidos por shRNAs. Además, las células conservaron su pluripotencia, así como su potencial de diferenciación, como lo demuestra su posterior diferenciación en diferentes linajes del SNC. El protocolo actual se ocupa de la entrega de shRNAs; sin embargo, el mismo enfoque podría utilizarse para la expresión ectópica de los ADNc para los estudios de sobreexpresión.

Introducción

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) derivadas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de factores externos en condiciones in vitro ^1,2. Con el fin de aprovechar plenamente el potencial de las hESC, es imperativo contar con métodos de administración de genes rápidos y confiables para estas células. Convencionalmente, las técnicas utilizadas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: sistemas de administración de genes no virales y virales ^3,4. ....

Protocolo

1. Transfección de células HEK293T utilizando el reactivo PEI o Lipofectamine 3000

1. Cultivo de células HEK293T en DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% co₂ y 21% O₂ hasta que sean 90% confluentes antes de la siembra para transfección. Utilice un número relativamente bajo de células de paso para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P30).
2. Sembrar 4 x 10⁶ células en 10 mL de medio de crecimiento completo en una placa de cultivo de tejido de 100 mm y crecer durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos....

Resultados

Después de la transferencia de genes, inevitablemente se requiere una alta viabilidad de hESCs. A pesar de los esfuerzos y la optimización de los protocolos para reducir la muerte celular después de la electroporación de hESCs, más del 50% de la muerte celular todavía se observa después de la electroporación de estas células, junto con la baja eficiencia de transfección²⁰. La transferencia de genes mediada por lentivirales no solo resulta en una alta eficiencia de transferencia de genes, sino que .......

Discusión

La capacidad de modificar genéticamente las células madre con fines de estudio o clínicos está limitada tanto por la tecnología como por la comprensión básica de la biología de las hESC. Las técnicas que han mostrado un potencial significativo en las ESC de ratón, como la lipofección y la electroporación, no son altamente eficientes para las hESC, que son notoriamente difíciles para la administración de genes por métodos convencionales²⁰. Esta noción ha llevado no solo a la optimización de las téc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol	Invitrogen	31350010
38,5 mL, Estéril + Libre Certificado Tubos Ultra Transparentes de Pared Delgada Abierta	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF	Invitrogen	PHG0261
Albúmina sérica bovina FRAC V	Invitrogen	15260037
Matriz de membrana basal Corning Matrigel sin LDEV Tecnologías de	Corning	354234
ciclopamina		72074
Medios DMEM	Invitrogen	11995073
DMEM Mezcla de nutrientes F12	Invitrogen	11320033
DPBS sin: Ca y Mg	PAN Biotech	P04-36500
Suero fetal bovie	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Anticuerpo mAb de conejo	CST	2118S
Reactivo de disociación celular suave	Tecnologías de células madre	7174
HyClone Aminoácidos no esenciales (NEAA) Solución 100X	GE healthcare	SH30238.01
L de glutamina, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Anticuerpo policlonal	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 medios completos	Stem Cell Technologies	85850
Medio neurobasal 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Suplemento 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Suplemento 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicilina estreptomicina SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 Vector TRC	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Reactivo para infecciones por polibreno	Sigma	TR1003- G
Polietilenimina, ramificada	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen
Inhibidor de ROCK Y-27632 diclorhidrato	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Tripsina .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10

humano recombinante células madre de A1113802