Visualización de las características morfológicas de la unión neuromuscular en el músculo gastrocnemio medial de rata

Resumen

El protocolo muestra un método para examinar la correlación espacial entre los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y las células de Schwann perisinápticas en el músculo gastrocnemio medial de la rata utilizando inmunohistoquímica fluorescente con diferentes biomarcadores, a saber, neurofilamento 200, transportador vesicular de acetilcolina, alfa-bungarotoxina y S100.

Resumen

La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja que sirve para la comunicación de señales desde la neurona motora hasta el músculo esquelético y consta de tres componentes histológicos esenciales: los terminales axónicos motores presinápticos, los receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Con el fin de demostrar las características morfológicas de la NMJ, el músculo gastrocnemio medial de rata se seleccionó como tejido objetivo y se examinó mediante el uso de múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores, incluido el neurofilamento 200 (NF200) y el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) para las fibras nerviosas motoras y sus terminales presinápticas, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para las AchR nicotínicas postsinápticas, y S100 para los PSC. En este estudio, la tinción se realizó en dos grupos: en el primer grupo, las muestras se tiñeron con NF200, VAChT y α-BTX, y en el segundo grupo, las muestras se tiñeron con NF200, α-BTX y S100. Se demostró que ambos protocolos pueden demostrar efectivamente la estructura detallada de NMJ. Utilizando el microscopio confocal, se observaron las características morfológicas de los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y el PSC, y se reconstruyeron sus imágenes de pilas Z en un patrón tridimensional para analizar más a fondo la correlación espacial entre los diferentes etiquetados. Desde la perspectiva de la metodología, estos protocolos proporcionan una referencia valiosa para investigar las características morfológicas de la NMJ en condiciones fisiológicas, que también pueden ser adecuadas para evaluar la alteración patológica de la NMJ, como la lesión y regeneración de los nervios periféricos.

Introducción

Como tres componentes estructurales esenciales de la unión neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, se han investigado ampliamente los aspectos morfológicos de los terminales axónicos motores presinápticos, la membrana postsináptica que contiene receptores nicotínicos de acetilcolina (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Se han examinado secciones delgadas y especímenes de montaje entero de los músculos esqueléticos con diferentes técnicas histológicas, como la microscopía electrónica ^5,6

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (aprobación No. 2021-04-15-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Las ratas fueron alojadas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y con libre acceso a alimentos y agua. Los instrumentos y materiales para este estudio se muestran en la Figura....

Resultados

Después de múltiples tinciones fluorescentes, el etiquetado correspondiente se demostró ordenadamente en las secciones de 80 μm de espesor del músculo gastrocnemio medial de rata con fibras nerviosas NF200 positivas, terminales presinápticos VAChT positivos, AchRs postsinápticas positivas α-BTX, PSC S100 positivas, fibras musculares positivas para faloidinas y núcleos celulares marcados con DAPI (Figura 3 y Figura 4).

Se demostró que .......

Discusión

Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para realizar con éxito la tinción múltiple de cortes musculares y el uso de inmunohistoquímica fluorescente para revelar las características morfológicas de NMJ en las secciones gruesas del músculo gastrocnemio medial de rata. Mediante el uso de este enfoque, los detalles finos y la correlación espacial de las PSC y los elementos pre y postsinápticos pueden analizarse y apreciarse bajo microscopía confocal, y reconstruirse aún más en un patrón tridimensional. Aquí, se util.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato	ThermoFisher	D3571
Microscopio de barrido láser confocal	Olympus	FV1200
Burro anti-pollo AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Burro anti-cabra AF546	ThermoFisher	A11056
Burro anti-conejo AF488	ThermoFisher	A21206
Burro anti-conejo AF546	ThermoFisher	A10040
Sección Congelada Medio	ThermoFisher	Neg-50	Microscopio Incoloro
cubreobjetos	Citotest	10212450C
Microtomo	Yamato	REM-710
Neurofilamento 200	Sigma-Aldrich	N4142	Conejo
Neurofilamento 200	Abcam	ab4680	Pollo
Suero de burro normal	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Suero	fisiológico normal Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehído	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Bomba peristáltica de precisión	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Conejo
Fosfato de sodio dbasic dodecahidrato	Macklin	S818118	500g
Fosfato de sodio monobásico dihidratado	Macklin	S817463	500g
Sacarosa	Macklin	S818046	500g
Portaobjetos de microscopio Superfrost plus	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Ciencias de la Vida	9002-93-1	100 ml
Transportador vesicular de acetilcolina	Milipore	ANB100	Cabra
&alfa;-bungarotoxina AF647 conjugado	ThermoFisher	B35450